劉 芳，汪 甜，王 楊，沈永寶

(南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037)

芫花(Daphne genkwa Sieb.et Zucc.)別名南芫花、芫花條、藥魚草等，為瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香屬(Daphne L.)的多年生落葉小灌木。芫花的干燥花蕾是著名的中藥材，具有利尿、鎮(zhèn)咳、祛痰、抑菌、引產(chǎn)、抗腫瘤等功效［1］；另外，芫花花色艷麗、花團(tuán)錦簇，具有良好的觀賞性［2］。目前，關(guān)于芫花的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理作用方面［1，3－6］，也有少量關(guān)于其組織培養(yǎng)［7］、遺傳多樣性［8］、病蟲害防治［9］等方面的研究報道，但對芫花的花粉形態(tài)及生理特性方面的研究尚未見報道。作者采用掃描電鏡觀察了芫花的花粉形態(tài)，并檢測了其花粉生活力和萌發(fā)率，以期為芫花種質(zhì)資源的利用和保護(hù)提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試芫花花粉采自南京市江寧區(qū)銅山鎮(zhèn)的丘陵地帶。隨機(jī)采集10株生長健壯的花枝，選取成熟花藥，用體積分?jǐn)?shù)4％戊二醛固定液(用體積分?jǐn)?shù)25％戊二醛和磷酸配制)固定后，放入冰盒內(nèi)帶回實驗室，用于掃描電鏡觀察；將剩余花枝直接帶回實驗室，用于花粉生活力測定和培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 花粉形態(tài)觀察 用0.1 mol·L－1磷酸緩沖液(pH 7.2)清洗芫花花粉，用體積分?jǐn)?shù)1％鋨酸(采用0.2 mol·L－1磷酸緩沖液配制，pH 7.2)固定后，再用0.1 mol·L－1磷酸緩沖液清洗，依次經(jīng)過體積分?jǐn)?shù)30％、50％、70％、90％、100％乙醇系列脫水，分別用體積比為1∶1和1∶2的無水乙醇－乙酸異戊酯置換2次，再用純乙酸異戊酯置換后，依次用HITACHI HCP－2型臨界點干燥儀和HITACHIE－1010型離子濺射儀(日本日立公司生產(chǎn))進(jìn)行干燥和鍍金，在FEIQUANTA－200型掃描電子顯微鏡(荷蘭FEI公司生產(chǎn))下觀察并拍照。共觀察3張制片，每張片選1個視野，每個視野統(tǒng)計50粒花粉的直徑，計算平均值。

1.2.2 花粉生活力測定 采用TTC染色法檢測芫花花粉生活力。隨機(jī)選取經(jīng)室溫水培催花24 h的成熟花粉，混合均勻后用毛筆蘸取少許置于載玻片上，滴入體積分?jǐn)?shù)0.1％TTC溶液1～2滴，蓋上蓋玻片，置于35℃恒溫箱中在黑暗條件下染色5 h，然后用OLYMPUSCX－41型顯微鏡(日本奧林巴斯公司生產(chǎn))觀察并拍照。共觀察3張制片，每片3個視野，統(tǒng)計每一視野中的花粉?？倲?shù)和染色花粉粒數(shù)，計算花粉生活力，結(jié)果取平均值。1.2.3 花粉萌發(fā)率測定 在10 g·L－1瓊脂中分別添加50、100、150、200、250和300 g·L－1蔗糖，作為花粉培養(yǎng)基，以不添加蔗糖的10 g·L－1瓊脂為對照。將培養(yǎng)基滴在凹面載玻片上，冷卻后用毛筆蘸取適量花粉均勻撒在培養(yǎng)基上，將載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃［10］的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h左右至花粉管不再伸長、萌發(fā)率不再增加為止。以花粉管長度超過花粉粒直徑作為花粉萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計花粉粒總數(shù)和已萌發(fā)的花粉粒數(shù)，計算花粉萌發(fā)率。每處理設(shè)3個重復(fù)，每一重復(fù)觀察1個視野。

1.3 數(shù)據(jù)處理

花粉生活力和花粉萌發(fā)率的計算公式分別為：花粉生活力=(染色花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù))×100％；花粉萌發(fā)率=(萌發(fā)的花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù))×100％。利用SPSS 13.0分析軟件對花粉萌發(fā)率的差異顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 芫花花粉的形態(tài)特征

芫花的花粉為單粒型，呈球形或近球形(圖1－1)；直徑15.6～21.6μm，平均直徑19.1μm?；ǚ哿Ｓ忻劝l(fā)孔10～16個，近均勻分布于花粉粒表面，萌發(fā)孔呈不規(guī)則圓形(圖1－2)，大小不一，孔徑1.4～2.0μm?；ǚ哿１砻婕y飾為粗網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，表面觀呈梅花形(圖1－3)；網(wǎng)格呈近四邊形至七邊形(多為五至六邊形)，網(wǎng)格的每個結(jié)點處膨大隆起，其基部呈近圓形或圓三角形，中部有1個乳突狀小突起，結(jié)點間由呈“T”形或“Y”形的網(wǎng)脊連接。

圖1 掃描電子顯微鏡下芫花花粉的形態(tài)特征Fig.1 Pollen morphology of Daphne genkwa Sieb.et Zucc.under SEM

2.2 芫花花粉的生活力分析

采用TTC法檢測芫花花粉的生活力，花粉的染色情況見圖2－1。統(tǒng)計結(jié)果顯示，芫花花粉的生活力為51％，花粉管的長度最終可以達(dá)到花粉粒直徑的10倍左右(圖2－2)。此外，芫花花粉萌發(fā)時出現(xiàn)“群體效應(yīng)”(圖2－3)。芫花花粉粒有多個萌發(fā)孔，有些花粉粒出現(xiàn)2個以上萌發(fā)孔同時萌發(fā)的現(xiàn)象，但只有1個花粉管或無花粉管可以正常生長(圖2－4)。

圖2 芫花花粉生活力的觀測結(jié)果Fig.2 Observation result of pollen viability of Daphne genkwa Sieb.et Zucc.

2.3 芫花花粉的萌發(fā)率分析

用含不同質(zhì)量濃度蔗糖的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，芫花花粉的萌發(fā)率有明顯差異，且蔗糖的質(zhì)量濃度較高不利于芫花花粉的萌發(fā)。其中，在含50 g·L－1蔗糖的培養(yǎng)基中花粉的萌發(fā)率最高，為27.0％，顯著高于對照(花粉萌發(fā)率6.2％)和其他處理組；在含100和150 g·L－1蔗糖的培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率差異不大，分別為10.7％和9.6％；在含200 g·L－1蔗糖的培養(yǎng)基中花粉萌發(fā)率較低，僅1.7％；培養(yǎng)基中蔗糖的質(zhì)量濃度達(dá)到250和300 g·L－1，花粉不再萌發(fā)。

方差分析結(jié)果(F=6.178，n=6)顯示：在含不同質(zhì)量濃度蔗糖的培養(yǎng)基中芫花花粉的萌發(fā)率差異極顯著(P＜0.01)。

3 結(jié)論和討論

芫花花粉表面紋飾為粗網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，每個網(wǎng)格的網(wǎng)脊中部有向內(nèi)的脊柱，頂部呈“T”形或“Y”形，常圍成不規(guī)則的五至六邊形或近圓形的網(wǎng)格；網(wǎng)格表面觀呈梅花形，網(wǎng)眼深陷穿孔，在網(wǎng)格的交接處(結(jié)點處)有乳突狀膨大的隆起，其基部呈近圓形或圓三角形，頂部則有1個乳突狀小突起。而劉炳侖［11］將此類紋飾描述為網(wǎng)狀－巴豆型，認(rèn)為此網(wǎng)格由呈圓形、圓三角形的薄片組成，薄片之間由長短不一的棒(網(wǎng)脊)連接或無短棒連接。作者認(rèn)為似有不妥。

通過TTC染色法和蔗糖離體培養(yǎng)法測得的芫花花粉生活力和萌發(fā)率均不高，可能是因為芫花花粉粒網(wǎng)眼多且大，使得花粉易失水變形，從而喪失生活力；此外，在花粉采集過程中，多風(fēng)和干燥的天氣也加速了花粉生活力的喪失。通過這兩種方法測得的花粉生活力也有很大差異，其中，用TTC染色法檢測時花粉著色深淺變化較大，僅靠肉眼判斷易造成實驗數(shù)據(jù)偏高；而用蔗糖離體培養(yǎng)時一部分具有生活力的花粉不一定能夠萌發(fā)，使得實驗數(shù)據(jù)偏低。

蔗糖具有調(diào)節(jié)滲透勢、促進(jìn)花粉萌發(fā)的作用。用于芫花花粉萌發(fā)的最佳蔗糖質(zhì)量濃度為50 g·L－1，此結(jié)果與張亞利等［12］的研究結(jié)果一致。在蔗糖質(zhì)量濃度高于100 g·L－1的條件下，花粉萌發(fā)率隨蔗糖質(zhì)量濃度的提高而下降，可能是由于高質(zhì)量濃度的蔗糖改變了花粉管的細(xì)胞透性，對花粉萌發(fā)不利。此外，芫花花粉萌發(fā)過程中還出現(xiàn)了多個萌發(fā)孔同時萌發(fā)的現(xiàn)象，目前花粉萌發(fā)2個以上花粉管的現(xiàn)象很少見［13］，有關(guān)花粉粒萌發(fā)多個花粉管的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和探討。

［1］張保獻(xiàn)，原思通，張靜修，等.芫花的現(xiàn)代研究概況［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，1995，2(10)：21－24.

［2］田朝陽，胡 穎，郭二輝，等.河南野生木本紫花觀賞植物資源調(diào)查分析［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008，36 (2)：134－142.

［3］張保獻(xiàn)，原思通，張靜修，等.芫花的現(xiàn)代研究概況(續(xù))［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，1995，2(11)：11－13.

［4］Zheng W F，Shi F.Isolation and identification of a new dicoumarin from the roots of Daphne genkwa［J］.藥學(xué)學(xué)報，2004，39(12)： 990－992.

［5］李玲芝，宋少江，高品一.芫花的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2007，24(9)：587－592.

［6］魏志文，高曉雯，鄭維發(fā).芫花根總黃酮抗腫瘤活性研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2008，24(2)：116－120.

［7］張恒基，柏新富，劉林德.芫花愈傷組織的分化與植株再生［J］.林業(yè)科技，2009，34(4)：78－81.

［8］王從彥，李曉慧，胡 穎，等.SRAP分子標(biāo)記分析芫花遺傳多樣性［J］.河南科學(xué)，2008，26(5)：554－556.

［9］萬少俠，李慧麗，雷超群，等.野生芫花植物防治天牛試驗［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009(8)：78，80.

［10］劉雪蓮，秦佳梅，劉麗娟.培養(yǎng)條件對返魂草花粉離體萌發(fā)的影響［J］.北方園藝，2009(12)：242－243.

［11］劉炳侖.我國瑞香科(Thymelaeaceae)植物的花粉形態(tài)［J］.植物研究，1984，4(2)：87－102.

［12］張亞利，田振坤，劉 燕.二喬玉蘭花粉貯存條件的比較研究［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2006，14(4)：318－320.

［13］張麗娜.百合屬植物花粉形態(tài)性狀及生活力的研究［D］.沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，2007：26.