王大慧 楊 波 衛(wèi)功元 丁志娟

（蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

提高產(chǎn)朊假絲酵母富硒能力的工藝條件研究

王大慧 楊 波 衛(wèi)功元 丁志娟

（蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

在5L發(fā)酵罐水平上研究不同培養(yǎng)條件對富硒產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞生長、谷胱甘肽合成和富硒能力的影響，通過分批發(fā)酵試驗確定較優(yōu)的培養(yǎng)方案：在發(fā)酵培養(yǎng)的第18小時加入20mg／L亞硒酸鈉，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速450r／min，L－蛋氨酸的添加濃度10mmol／L。該條件下，酵母細(xì)胞干重為11.32g／L，胞內(nèi)谷胱甘肽和有機(jī)硒含量分別達(dá)到11.5mg／g和1 352μg／g，該方案為高性能（高胞內(nèi)谷胱甘肽含量、高有機(jī)硒含量）富硒產(chǎn)朊假絲酵母的高效制備奠定了基礎(chǔ)。

產(chǎn)朊假絲酵母；有機(jī)硒；谷胱甘肽

谷胱甘肽（GSH）是存在于細(xì)胞內(nèi)最豐富的小分子硫醇類化合物［1］，對于維持生物體內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境起著至關(guān)重要的作用［2］。硒是生物體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）的重要組成部分，而GSH－Px可以分解生物體內(nèi)的有害過氧化物，清除自由基，防止細(xì)胞膜氧化受損［3］，硒還具有保護(hù)心臟、維持心血管系統(tǒng)正常結(jié)構(gòu)和功能的作用［4－5］。1973年，硒被世界衛(wèi)生組織確定為人體必需的微量元素。

硒的攝入可以明顯降低癌癥的發(fā)生率［6］，硒的補(bǔ)充可以通過攝入無機(jī)硒或有機(jī)硒得以實現(xiàn)。無機(jī)硒毒性較高，因而限制了其使用范圍；有機(jī)硒雖然安全性能和利用率較高，但常用的硒代蛋氨酸價格昂貴，因此有必要尋找一種廉價的有機(jī)硒產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法。利用微生物如產(chǎn)朊假絲酵母將無機(jī)硒生物轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒被認(rèn)為是一條安全高效的途徑［7］。作為一種安全可靠（GRAS）生物，產(chǎn)朊假絲酵母已經(jīng)被美國FDA認(rèn)證，可作為食品添加劑的酵母，并能運(yùn)用于食品和制藥行業(yè)。中國農(nóng)業(yè)部于1999年6月就已將產(chǎn)朊假絲酵母確定為12種微生物飼料添加劑之一。

在富硒酵母的發(fā)酵法制備過程中，營養(yǎng)條件以及培養(yǎng)環(huán)境等因素都對酵母細(xì)胞富硒能力產(chǎn)生重要影響。中國已有學(xué)者對這些因素進(jìn)行研究［7－10］，但大都集中在搖瓶水平上，鮮有在發(fā)酵罐水平上的研究報道。此外，由于GSH的生理學(xué)意義，胞內(nèi)富含GSH的富硒酵母將更具有應(yīng)用價值［7］。本試驗以一株能夠在胞內(nèi)積累GSH的產(chǎn)朊假絲酵母作為出發(fā)菌株，以富硒酵母的高性能（高GSH含量、高有機(jī)硒含量）為目標(biāo)，通過研究分批發(fā)酵過程中影響酵母細(xì)胞生長、GSH合成和富硒能力的因素，奠定高性能富硒酵母的制備為基礎(chǔ)。由于此種酵母在補(bǔ)充硒的同時還能夠提高機(jī)體的免疫力，因此在食品、醫(yī)藥、保健品和飼料添加劑等多種領(lǐng)域都將具有更為廣闊的市場和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilisSZU 07－01）：蘇州大學(xué)微生物工程實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g／L，蛋白胨10.0g／L，酵母膏10.0g／L，pH 6.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30.0g／L，硫酸銨8.0g／L，磷酸二氫鉀3.0g／L，硫酸鎂0.25g／L，pH 5.5。

1.1.3 儀器和試劑

攪拌式發(fā)酵罐：BIOTECH－5BGZ，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；

恒溫?fù)u瓶柜：HZ－2010K，太倉市華利達(dá)實驗儀器設(shè)備公司；

高壓蒸氣滅菌鍋：LDZX－50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠；

超凈工作臺：SW－CJ－2A，吳江市龍宏凈化設(shè)備有限公司；

離心機(jī)：LD4－2A，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

分析天平：JA2003，上海天平儀器有限公司；

722型分光光度計：T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

5，5’－二硫－雙（2－硝基苯甲酸）（DTNB）、NADPH 和谷胱甘肽還原酶：美國Sigma公司；

其它試劑：均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 一級種子培養(yǎng) 將斜面種子活化4h后接入50mL種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r／min。

1.2.2 二級種子培養(yǎng) 將一級種子按10%（V／V）的接種量接入種子培養(yǎng)基（50mL／500mL），培養(yǎng)20h，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200r／min。

1.2.3 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng) 全自動5L攪拌式發(fā)酵罐中裝發(fā)酵培養(yǎng)基3L，接種量10% （V／V），溫度27℃，pH 5.5，通氣量3.0L／min，發(fā)酵時間30h。除非特別說明，攪拌轉(zhuǎn)速為400r／min。pH采用梅特勒電極在位檢測，通過自動流加3mol／L H2SO4或3mol／L NaOH溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)以維持pH變化在±0.02以內(nèi)。發(fā)酵結(jié)束檢測細(xì)胞干重、GSH含量和有機(jī)硒含量等指標(biāo)。

1.3 分析方法

1.3.1 葡萄糖濃度的測定 3，5－二硝基水楊酸法［11］。

1.3.2 細(xì)胞干重（DCW）的測定 取20mL發(fā)酵液，3 500r／min離心10min，蒸餾水離心洗滌3次，收集菌體，70℃烘干至恒重稱重，計算出細(xì)胞干重。

1.3.3 胞內(nèi)GSH含量的測定 DTNB－谷胱甘肽還原酶循環(huán)法［11］。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)無機(jī)硒、總硒含量的測定 見文獻(xiàn)［11］。

1.3.5 胞內(nèi)有機(jī)硒含量的計算 見式（1）。

有機(jī)Se含量（μg／g）＝［胞內(nèi)總Se含量（μg／L）－胞內(nèi)無機(jī)Se含量（μg／L）］酵母細(xì)胞干重（g／L） （1）

2 結(jié)果與分析

2.1 C. utilis SZU 07－01生長曲線

在5L發(fā)酵罐水平上首先考察了C.utilisSZU 07－01細(xì)胞的生長和代謝情況。由圖1可知，在酵母細(xì)胞培養(yǎng)15h時，葡萄糖基本消耗完畢，細(xì)胞干重在18h達(dá)到最大值13.05g／L，胞內(nèi) GSH在27h達(dá)到133.3mg／L。在這些時間點(diǎn)的基礎(chǔ)上，以下考察不同時間添加Na2SeO3對富硒產(chǎn)朊假絲酵母性能的影響。

圖1 C. utilis SZU07－01分批培養(yǎng)過程曲線Figure 1 Time－course of batch culture process with C. utilis SZU 07－01

2.2 Na2SeO3添加時間對富硒酵母制備的影響

根據(jù)C.utilisSZU07－01菌株生長的特點(diǎn)，分別在培養(yǎng)過程中的不同時間添加15mg／L 的 Na2SeO3，27 ℃、400r／min下培養(yǎng)30h，考察富硒酵母的生長和代謝變化情況，結(jié)果見圖2。由圖2可知，發(fā)酵開始階段添加Na2SeO3對細(xì)胞生長、GSH合成和有機(jī)硒轉(zhuǎn)化均產(chǎn)生不利影響。綜合考慮，在18h添加Na2SeO3較為合適，此時細(xì)胞干重為10.87g／L，胞內(nèi)GSH含量和有機(jī)硒含量分別為11.0mg／g和983μg／g。

圖2 Na2SeO3添加時間對富硒酵母制備的影響Figure 2 Effect of Na2SeO3addition time on the preparation of selenium－enriched yeast

2.3 Na2SeO3濃度對富硒酵母制備的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)的18h添加不同濃度的Na2SeO3，27℃、400r／min下培養(yǎng)30h，考察富硒酵母的生長和代謝變化情況。結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng) Na2SeO3濃度低于20mg／L時，其添加只對細(xì)胞生長和GSH合成產(chǎn)生輕微影響，但明顯提高了胞內(nèi)有機(jī)硒含量。而當(dāng)Na2SeO3濃度大于25mg／L時，胞內(nèi)GSH含量、有機(jī)硒含量大幅度下降。因此，確定Na2SeO3的添加濃度為20mg／L。

圖3 不同Na2SeO3濃度對富硒酵母制備的影響Figure 3 Effect of Na2SeO3concentration on the preparation of selenium－enriched yeast

2.4 攪拌轉(zhuǎn)速對高性能富硒酵母制備的影響

發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速影響到罐內(nèi)的溶氧，研究了不同攪拌轉(zhuǎn)速對細(xì)胞生長和代謝情況的影響，27℃下培養(yǎng)30h，其中在18h添加20mg／L Na2SeO3，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速的增大，罐內(nèi)溶氧濃度增大，細(xì)胞生物量、胞內(nèi)GSH含量和有機(jī)硒含量也隨之增加，細(xì)胞干重和有機(jī)硒含量在450r／min時達(dá)到最大值。當(dāng)轉(zhuǎn)速大于450r／min時，細(xì)胞干重和胞內(nèi)有機(jī)硒含量沒有明顯增加。因此，確定發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為450r／min。

圖4 攪拌轉(zhuǎn)速對富硒酵母制備的影響Figure 4 Effect of agitation rate on the preparation of selenium－enriched yeast

2.5 L－蛋氨酸添加濃度對富硒酵母制備的性能

蛋氨酸是S－腺苷甲硫氨酸（SAM）的直接底物，SAM在一定條件下可轉(zhuǎn)變?yōu)殡装彼岷桶腚装彼幔腚装彼釀t是促進(jìn)GSH合成的關(guān)鍵性底物［12］。前期研究［11］發(fā)現(xiàn)，在分批培養(yǎng)時添加L－蛋氨酸可以促進(jìn)富硒產(chǎn)朊假絲酵母的生長，同時也可以提高胞內(nèi)GSH含量和硒的有機(jī)轉(zhuǎn)化率。因此，在發(fā)酵開始時（0h）添加不同濃度的L－蛋氨酸，同時在18h添加20mg／L的Na2SeO3進(jìn)行富硒酵母的制備，27℃、450r／min下培養(yǎng)30h，結(jié)果見圖5。當(dāng)L－蛋氨酸的添加濃度為10mmol／L時，細(xì)胞生物量、胞內(nèi)GSH和有機(jī)硒含量均達(dá)到最大值，分別為11.32g／L，11.5mg／g和1 352μg／g。

圖5 蛋氨酸的添加對富硒酵母制備的影響Figure 5 Effect of methionine addition on the preparation of selenium－enriched yeast

3 討論

在富硒產(chǎn)朊假絲酵母的制備過程中，高濃度的Na2SeO3會影響生長期酵母細(xì)胞的正常生長和代謝［7］，所以合適的Na2SeO3添加時間對于提高富硒酵母的性能十分必要。本試驗研究結(jié)果顯示生長期的酵母細(xì)胞對硒的富集能力（胞內(nèi)有機(jī)硒含量）差別不大，因此，為了不影響酵母細(xì)胞的正常生長，Na2SeO3最好在細(xì)胞生長結(jié)束時（18h）進(jìn)行添加。

與前人研究［9－10］相比，雖然本試驗制備的富硒產(chǎn)朊假絲酵母在胞內(nèi)有機(jī)硒含量上尚有差距，但該種酵母的顯著特點(diǎn)在于細(xì)胞內(nèi)含有有機(jī)硒的同時還含有豐富的GSH。然而，酵母胞內(nèi)GSH含量在富集硒的過程中有所下降，原因主要有：①Na2SeO3的添加會導(dǎo)致部分胞內(nèi)GSH分泌到胞外［13］；② 胞內(nèi)硒的積累將會提高谷胱甘肽過氧化物酶的活性，而谷胱甘肽過氧化物酶在作用時需要消耗直接底物GSH［3］。為此，在前期研究［7，11］的基礎(chǔ)上，本試驗通過合適的溶氧控制以及蛋氨酸的添加實現(xiàn)了胞內(nèi)的GSH含量的保持和提高。

本試驗以富硒產(chǎn)朊假絲酵母的高性能（高GSH含量和高有機(jī)硒含量）為目標(biāo)，在發(fā)酵罐水平上通過對影響產(chǎn)朊假絲酵母富硒能力的因素進(jìn)行研究，獲得了較優(yōu)的富硒酵母培養(yǎng)條件，即在發(fā)酵培養(yǎng)的第18小時加入20mg／L亞硒酸鈉，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速450r／min，L－蛋氨酸的添加濃度10mmol／L。在此條件下，酵母細(xì)胞干重為11.32g／L，胞內(nèi)GSH和有機(jī)硒含量分別達(dá)到11.5mg／g和1 352μg／g，研究結(jié)果為高性能富硒產(chǎn)朊假絲酵母的高效制備奠定基礎(chǔ)。由于該種富硒產(chǎn)朊假絲酵母同時具有較強(qiáng)的GSH合成能力和較高的有機(jī)硒含量，因此必將具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

1 Spector D，Labarre J，Toledano M B.A genetic investigation of the essential role of glutathione［J］.Biol.Chem.，2001，276（10）：7 011～7 016.

2 Li Y，Wei G，Chen J.Glutathione：a review on biotechnological production［J］.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2004，66（3）：233～242.

3 Fairweather－Tait S J，Bao Y P，Broadley M R，et al.Selenium in human health and disease［J］.Antioxid.Redox Sign.，2011，14：1 337～1 383.

4 Zagrodzki P，Laxzczyk P.Selenium and cardiovascular disease：selected issues［J］.Postepy Hig.Med.Dosw，2006，60：624～631.

5 Jelicks L A，de Souza A P，Araújo－Jorge T C.Would selenium supplementation aid in therapy for chagas disease［J］.Trends Parasitol.，2011，27（3）：102～105.

6 Rayman M P.Selenium in cancer prevention：a review of the evidence and mechanism of action［J］.Proc.Nutr.Soc.，2005，64（4）：527～542.

7 葛曉光，衛(wèi)功元，聶敏，等.富硒產(chǎn)朊假絲酵母的制備條件研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2009（10）：31～33.

8 柴麗紅，苗丹.安琪活性干酵母的富硒研究［J］.食品與機(jī)械，2005，21（6）：38～40.

9 牛海濤，湯燕花.利用產(chǎn)朊假絲酵母轉(zhuǎn)化無機(jī)硒為有機(jī)硒的研究［J］.飼料工業(yè)，2006，27（20）：16～18.

10 宋一恒，謝定，鐘海雁.響應(yīng)面法優(yōu)化酵母富硒發(fā)酵條件［J］.食品與機(jī)械，2009，25（6）：125～130.

11 Ge X，Wang D，Wei G，et al.Improvement of physiological characteristic of selenium－enriched Candida utilis with amino acids addition［J］.Biotechnol.Res.Int.，2010，2 011：1～7.

12 Brosnan J T，Brosnan M E，Bertolo R F P，et al.Methionine：a metabolically unique amino acid［J］.Livestock Science，2007，112：2～7.

13 Iizuka M，Murata K，Kimura A.Induction of glutathione leakage from Saccharomyces cerevisiae cells by selenite［J］.Agric.Biol.Chem.，1988，52（2）：613～614.

Study on conditions for selenium enrichment improving ofCan dida utilis

WANG Da－h(huán)ui YANG Bo WEI Gong－yuan DING Zhi－juan

（School of Biology and Basic Medical Sciences，Soochow University，Suzhou，Jiangsu215123，China）

Studied the effects of different culture conditions on cell growth of selenium－enrichedCandida utilis，the ability of glutathione biosynthesis and selenium enrichment cultured in a 5Lstirred fermentor.An optimum combination of culture conditions which involved 20mg／L sodium selenite added to the culture medium at 18h，together with agitation rate of 450r／min and 10mmol／L L－methionine added at 10h，were achieved under batch fermentation withC.utilisSZU 07－01.Under these optimal conditions，the dry cell weight was 11.32g／L，and the contents of intracellular glutathione and organic selenium were 11.5mg／g，1 352μg／g，respectively.This study laid a foundation for the efficient preparation of high quality（high intracellular glutathione and high organic selenium content）selenium－enrichedCandida utilis.

Candida utilis；organic selenium；glutathione

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.06.065

江蘇省屬高校自然科學(xué)研究項目（編號：09KJB530009）

王大慧（1975－），女，蘇州大學(xué)講師，碩士。E－mail：wdahui＠163.com

衛(wèi)功元

2011－08－01