鐘世剛，趙月柳，霍洪亮

（東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130024）

雌激素對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌鈣離子的影響

鐘世剛，趙月柳，霍洪亮

（東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130024）

雌激素對(duì)心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用，但其保護(hù)機(jī)制尚未完全闡明.缺氧／復(fù)氧可引起心肌細(xì)胞損傷，其中發(fā)生鈣超載是心肌損傷的一個(gè)重要因素.進(jìn)行了雌激素對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響研究.結(jié)果顯示：心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，呈復(fù)氧時(shí)間依賴性增加.雌激素有抑制缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高的作用，能有效防止心肌細(xì)胞鈣超載.

雌激素；缺氧／復(fù)氧；鈣超載

細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2＋）參與不同酶系和各種類型細(xì)胞生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)，這些功能只需要極微量的游離鈣離子.心肌缺氧／復(fù)氧損傷可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平明顯升高，產(chǎn)生鈣超載現(xiàn)象.1972年Shen和Jennings發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)鈣超載在心肌缺血／灌注損傷發(fā)病機(jī)制中起主導(dǎo)作用［1］.在心肌缺血／灌注過(guò)程中有效抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載是保護(hù)心肌的重要途徑之一.鈣離子拮抗劑、鈉鈣交換蛋白（sodium－calcium exchange，NCX）抑制劑均能有效減輕鈣超載的發(fā)生，減輕心肌缺血／灌注損傷，具有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用［2－4］.有實(shí)驗(yàn)表明，給雙側(cè)卵巢切除大鼠大劑量補(bǔ)充外源性雌激素能直接阻滯心肌細(xì)胞Ca2＋通道，產(chǎn)生負(fù)性肌力作用，減少心肌耗能，防止心肌細(xì)胞缺血時(shí)Ca2＋超載引起的心肌細(xì)胞壞死，保護(hù)心肌細(xì)胞的收縮功能［5］.為進(jìn)一步證明雌激素對(duì)鈣超載的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)利用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞，采用缺氧／復(fù)氧模型模擬心肌缺血再灌注損傷，觀察了17－β雌二醇對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，為臨床正確利用雌激素保護(hù)心血管功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

取新生1～3 d的Sprague－Dawley（SD）大鼠（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）心肌，原代細(xì)胞培養(yǎng)，72 h后更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液.采用Koyama等方法配制缺氧液和復(fù)氧液，進(jìn)行缺氧／復(fù)氧處理.雌激素（17－β雌二醇5μmol／L）于缺氧／復(fù)氧處理前24 h加入.

1.2 方法

1.2.1 MTT檢測(cè)

以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞，細(xì)胞密度為5×104個(gè)／孔，每組5個(gè)復(fù)孔；空白對(duì)照孔組只有培養(yǎng)液不含細(xì)胞.用10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)24 h，缺氧／復(fù)氧損傷后在培養(yǎng)基中加入5 g／L的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h.棄上清液，每孔加入200μL二甲基亞砜，室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀于490 nm處讀取吸光值.

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

以0.25%胰酶消化收集各組心肌細(xì)胞，用D－HANKS洗滌樣本2次后，重懸細(xì)胞于EP管中，室溫避光條件下用Fluo－3／AM（0.01 g／L）負(fù)載細(xì)胞約30 min.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組心肌細(xì)胞鈣離子濃度.

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)

將Fluo－3／AM溶于二甲基亞砜中，按1 g／L配制，混勻后－20℃保存.用D－HANKS洗滌細(xì)胞玻片2次，在室溫避光條件下用Fluo－3／AM（0.01 g／L）負(fù)載細(xì)胞約30 min，再用D－HANKS沖洗細(xì)胞2～3次，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照.

1.2.4 鈣瞬變及鈣濃度檢測(cè)

用溶解有2.5μmol／L Fluo－3和20%Pluronic F－127的臺(tái)式液37℃孵育心肌細(xì)胞30 min，再用臺(tái)式液沖洗3次洗去多余染料.利用激光共聚焦顯微鏡以線掃描的方式檢測(cè)胞內(nèi)自發(fā)性鈣瞬變.用波長(zhǎng)488 nm的氬激光激發(fā)，在560～660 nm間接收發(fā)射光，采樣速率為1.65 ms／線，沿細(xì)胞長(zhǎng)軸縱向正中切面的中央進(jìn)行掃描，然后進(jìn)行圖像處理和數(shù)據(jù)分析.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.應(yīng)用SigmaStat3.5軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，應(yīng)用onesamples T－Test分析或one－way ANOVA分析，P＜0.05為組間比較差異有顯著性.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 MTT檢測(cè)各組心肌細(xì)胞活性變化

2.1 缺氧／復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響

如圖1所示，由于活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶使MTT溶液還原為難溶的藍(lán)紫色結(jié)晶，后者被二甲基亞砜溶解.根據(jù)490 nm處吸光值間接判斷細(xì)胞存活率，缺氧／復(fù)氧損傷組細(xì)胞活性比對(duì)照組明顯降低（P＜0.05）；雌激素組細(xì)胞活性明顯高于缺氧／復(fù)氧組（P＜0.05）.

2.2 復(fù)氧時(shí)間對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

如圖2所示，正常對(duì)照組心肌細(xì)胞鈣離子平均熒光強(qiáng)度為7.4±1.3，缺氧／復(fù)氧損傷后，鈣離子熒光值有顯著增加，并隨復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加強(qiáng)，復(fù)氧1，2，4 h時(shí)分別為13.85±4.9，30.18±1.8，51.25±1.4，均明顯高于正常組，表明鈣離子濃度隨損傷組復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)顯著升高.

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同復(fù)氧時(shí)間組心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化

2.3 雌激素對(duì)細(xì)胞鈣離子濃度影響

心肌細(xì)胞鈣離子的累積光密度值正常對(duì)照組為4 376.348±18.55，缺氧／復(fù)氧（H 2 h／R 2 h）損傷組為16 280.3±27.64，明顯高于正常組（P＜0.05）；實(shí)施雌激素孵育組心肌細(xì)胞鈣離子的累積光密度值較損傷組明顯減低（P＜0.05），見(jiàn)圖3.

圖3 免疫熒光檢測(cè)各組心肌鈣離子濃度變化

2.4 雌激素對(duì)鈣瞬變的影響

心肌細(xì)胞自律性收縮時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，缺氧／復(fù)氧損傷能破壞細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)平衡.鈣瞬變檢測(cè)結(jié)果表明：缺氧／復(fù)氧組心肌細(xì)胞鈣瞬變峰值和半高寬均有增加（見(jiàn)圖4）.峰值反映在鈣瞬變過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)流和鈣庫(kù)肌漿網(wǎng)釋放鈣的最大量，半高寬（鈣信號(hào)強(qiáng)度超過(guò)峰值一半部分）反映鈣瞬變過(guò)程中高濃度鈣所持續(xù)的時(shí)間.缺氧／復(fù)氧損傷導(dǎo)致細(xì)胞鈣通透增加，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度（峰值）增加19.0%.缺氧／復(fù)氧損傷還導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子外排和肌質(zhì)網(wǎng)的攝入，鈣離子在胞漿中滯留時(shí)間加長(zhǎng).鈣瞬變時(shí)程（半高寬）增加78.5%.Ca2＋超載能加重心肌細(xì)胞損傷.

圖4 心肌細(xì)胞鈣瞬變激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果

3 討論

雌激素的抗氧化作用曾在Kim等的研究結(jié)果中得到了證明［6－7］.心肌缺氧／復(fù)氧導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，使鈣離子通透性增強(qiáng)，鈣離子內(nèi)流增加，導(dǎo)致高濃度鈣離子在胞漿中滯留時(shí)間加長(zhǎng)，鈣瞬變幅值增大，增加線粒體對(duì)鈣離子的攝取.因此，缺氧／復(fù)氧損傷破壞了細(xì)胞內(nèi)能量代謝鏈，細(xì)胞膜鈣泵外排鈣離子能力和肌質(zhì)網(wǎng)攝鈣能力下降，影響心肌的正常生理活動(dòng).1992年Jiang報(bào)道了雌激素能夠抑制豚鼠心肌的L型鈣通道，后來(lái)人們相繼運(yùn)用不同的實(shí)驗(yàn)方法得到了相似的結(jié)果.2001年高瞻的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明雌激素能降低收縮心肌細(xì)胞的鈣瞬變，并且具有劑量依賴性.進(jìn)一步的研究證明，雌激素通過(guò)抑制鈣超載對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用.本實(shí)驗(yàn)中，缺氧／復(fù)氧時(shí)間與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度呈正相關(guān).雌激素處理后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、鈣瞬變幅值和半高寬均小于缺氧／復(fù)氧損傷組，因此，雌激素能夠參與鈣離子活動(dòng)的有序調(diào)控.這可能是雌激素對(duì)心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一.

［1］SHEN A C，J ENNINGS R B.Kinetics of calcium accumulation in acute myocardial ischemic injury［J］.Am Pat hol，1972，67：441－442.

［2］MOUKARBEL G V，AYOUB C M，ABCHEE A B.Pharmacological therapy for myocardial reperfusion injury［J］.Curr Opin Pharmacol，2004，4（2）：147－153.

［3］TAKAHASHI K，TAKAHASHI T，SUZUKI T，et al.Protective effects of SEA0400，novel and selective inhibitor of the Na＋／Ca2＋exchanger，myocardial ischemia－reper fusion injuries［J］.Eur Pharmacol，2003，458：155－162.

［4］MAGEE W P，DESHMUKH G，DENINNO M P，et al.Differing cardiop rotective efficacyof the Na＋／Ca2＋exchanger inhibitors SEA0400 and KB2R7943［J］.Am Physiol，2003，284：H903－H910.

［5］SANG HUI CHU，PAUL GOLDSPINK，JILL KOWALSKI，et al.Effect of estrogen on calcium－h(huán)andling proteins，β－adrenergic receptors and function in rat heart［J］.Life Sciences，2006，79：1257－1267.

［6］SUGISHITA K，LI F，SU Z，et al.Anti－oxidant effects of estrogen reduce［Ca2＋］during metabolic inhibition［J］.Mol Cell Cardiol，2003，35（3）：331－336.

［7］LEE T M，LIN M S，CHOU T F，et al.Adjunctive 17beta－estradiol administration reduces infarct size by altered expression of canine myocardial connexin43 protein［J］.Cardiovasc Res，2004，63（1）109－117.

Effect of rstrogen on calcium concentration in myocardial cells suffering from Hypoxia／Reoxygenation

ZHONG Shi－gang，ZHAO Yue－liu，HUO Hong－liang

（School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China）

Estrogen can protect myocardial cells from Hypoxia／Reoxygenation injury，but the mechanism is not fully understood.Hypoxia／Reoxygenation can causes myocardial cells injury，in which the occurrence of calcium overload is an important factor.The aim of this study is mainly to investigate the effect of estrogen on calcium concentration in myocardial cells suffering from Hypoxia／Reoxygenation.Results shows that：after Hypoxia／Reoxygenation，the Calcium concentration in myocardial cells increased significantly，and in a Reoxygenation time－dependent manner.Estrogen can inhibit this increase induced by Hypoxia／Reoxygenation，and effectively prevent calcium overload in myocardial cells.

estrogen；Hypoxia／Reoxygenation；calcium overload

Q 463

180·2417

A

1000－1832（2011）04－0118－04

2011－06－23

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（200905103）.

鐘世剛（1982—），男，碩士研究生；通訊作者：霍洪亮（1963—）男，博士，副教授，主要從事心血管炎性機(jī)制研究.

方 林）