王 華， 周 濱， 郭 星， 朱雋雅， 程 春， 朱昌來， 張?zhí)煲弧?/p>

(南通大學(xué)1 附屬醫(yī)院普外科，2 醫(yī)學(xué)院，3 神經(jīng)再生重點(diǎn)實驗室，江蘇 南通226001)

人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2，Rh2)是中草藥人參所含的重要活性成分之一，國內(nèi)外學(xué)者研究證實了Rh2對多種惡性腫瘤細(xì)胞具有顯著的抗轉(zhuǎn)移作用［1，2］。另外，也有學(xué)者研究表明，人參皂苷還對腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化作用，但其具體作用機(jī)制尚不清，尤其是對腫瘤細(xì)胞骨架的影響尚未闡明，而細(xì)胞骨架構(gòu)型的改變是腫瘤細(xì)胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移的重要因素之一［3］。本研究通過分析Rh2對SMMC－7721 細(xì)胞增殖及細(xì)胞骨架影響，為探討Rh2對惡性腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化后轉(zhuǎn)良的過程提供一些實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

SMMC－7721 細(xì)胞株(中科院細(xì)胞所);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);MTT 試劑(Fluka);FITC－phalloidin(上海聯(lián)科生物科技);人參皂苷Rh2(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio－Tek);流式細(xì)胞儀(FACS Callibur，BD);激光共聚焦顯微鏡(TCS－SP2，Leica);透射電子顯微鏡(JEM－1230，JEOL)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC－7721 細(xì)胞生長于含10%胎牛血清的DMEM(低糖)培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

2.2 MTT 法測細(xì)胞生長抑制率 將培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞按5 ×107/L 的密度接種于96 孔板，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液。實驗設(shè)置空白對照組及4 個實驗組(每組終濃度分別為10、20、30、40 mg/L Rh2)，每組設(shè)置4 個平行孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱里分別培養(yǎng)2 d、4 d、6 d 后MTT 法測定波長為570 nm 處各孔的吸光度(A)值。

細(xì)胞生長抑制率=(1－實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞按5 ×107/L 的密度接種于24 孔培養(yǎng)板，每孔0.5mL。實驗設(shè)置空白對照組及實驗組(每組終濃度分別為10、20、40 mg/L Rh2)，每組設(shè)置4個平行孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱里分別培養(yǎng)4 d。收集上述各組細(xì)胞，PBS 漂洗，4℃70%乙醇固定細(xì)胞24 h，離心去除乙醇，漂洗后重懸細(xì)胞于0. 5 mL PBS 中，加入5 g/L RNase A 10 μL，37 ℃水浴中孵育30 min 后，加入1 g/L 的碘化丙啶25 μL，4 ℃染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架肌動蛋白絲 根據(jù)MTT 及流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果確定孔內(nèi)先置入經(jīng)無菌處理過的圓形蓋玻片，將細(xì)胞按5 ×107/L 的密度接種于24 孔培養(yǎng)板，每孔0. 5mL。設(shè)空白對照組和實驗組(10、20 mg/L Rh2)，每組設(shè)4 個復(fù)孔。作用4 d 后，PBS 漂洗2 次，加入4%多聚甲醛4 ℃固定過夜，PBS 漂洗2 次，Hoechst33258 室溫避光孵育15 min，PBS 漂洗，F(xiàn)ITC－phalloidin 室溫避光孵育2h，PBS 漂洗、無熒光封片劑封片檢測。

2.5 整裝電鏡技術(shù)觀察細(xì)胞核基質(zhì)－中間纖維系統(tǒng) 參照文獻(xiàn)方法［4］，將細(xì)胞接種于鎳網(wǎng)(預(yù)先覆蓋Formvar 膜、噴碳并涂0.1%多聚賴氨酸紫外線照射滅菌30 min ，置于24 孔培養(yǎng)板內(nèi))，設(shè)空白對照組及實驗組(10、20 mg/L 的Rh2)。作用4 d 后，培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)PBS 37 ℃下漂洗2 次，4 ℃下高離子強(qiáng)度提取液［PIPES 10 mmol/L，(NH4)2SO4250 mmol/L，sucrose 300 mmol/L，MgCl23 mmol/L，PMSF 1. 2 mmol/L，Triton X－100 0.5%，pH 6.8］抽提3 min，無酶消化液(PIPES 10 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，sucrose 300 mmol/L，MgCl23 mmol/L，PMSF 1.2 mmol/L，Triton X－100 0.5%，pH 6.8)漂洗。含酶消化液(DNase I 400 mg/L;RNase A 400 mg/L)23 ℃下消化20 min，再經(jīng)高離子強(qiáng)度提取液23 ℃下再抽提5 min。2% 戊二醛(無酶消化液配制)于4 ℃預(yù)固定30 min;0.1 mol/L 二甲砷酸鈉緩沖液(pH 7.4)漂洗后，再用1%鋨酸4 ℃固定5 min，并經(jīng)乙醇梯度脫水、叔丁醇置換、冷凍干燥后透射電鏡下觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理采用Stata 7.0 軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 Rh2 對人肝癌細(xì)胞生長抑制作用

Rh2對SMMC－7721 細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用，其抑制率分別與藥物的劑量及處理時間呈正相關(guān)，見表1。

表1 人參皂苷Rh2 對SMMC－7721 細(xì)胞增殖的影響Table 1. Effect of Rh2 on the proliferation of SMMC－7721 cells(±s.n=4)

表1 人參皂苷Rh2 對SMMC－7721 細(xì)胞增殖的影響Table 1. Effect of Rh2 on the proliferation of SMMC－7721 cells(±s.n=4)

* P ＜0.05 vs control group.

Group 2 d 4 d 6 d A value Inhibitory rate(%) A value Inhibitory rate(%) A value Inhibitory rate(%)Rh210 mg/L 0.42 ±0.06* 28.70 ±0.30 0.61 ±0.23* 31.50 ±0.52 0.98 ±0.23*44.30 ±0.28 Rh220 mg/L 0.35 ±0.04* 34.10 ±0.25 0.56 ±0.08* 42.90 ±0.42 0.85 ±0.33* 51.60 ±0.46 Rh240 mg/L 0.15 ±0.05* 73.30 ±0.39 0.10 ±0.02* 87.40 ±0.71 0.97 ±0.21* 88.30 ±0.39 Control 0.55 ±0.02－0.85 ±0.12－1.68 ±0.15－

2 Rh2 對人肝癌細(xì)胞凋亡率的影響

采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞數(shù)量百分比，紅色峰代表正常的二倍體，淡藍(lán)色峰代表亞二倍體，即凋亡峰，峰的高度代表凋亡率。作用4 d 后，40 mg/L 組的細(xì)胞凋亡率約為(31.93 ±0.52)%，明顯大于同期空白組及10 mg/L、20 mg/L 組［(4. 55 ±0. 23)%、(4. 81 ±0. 31)%、(5. 10 ±0.45)%］，說明高濃度人參皂苷Rh2對SMMC－7721 細(xì)胞有明顯促進(jìn)凋亡的作用，而較低濃度時誘導(dǎo)凋亡的作用較弱，見圖1。

3 Rh2 對人肝癌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)F－actin 的影響

人參皂苷Rh2作用4 d 后，通過熒光雙標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明，對照組SMMC－7721 細(xì)胞微絲顯示紊亂，排列無序，數(shù)量較少，見圖2A;10 mg/L Rh2作用下，F(xiàn)－actin 排列仍紊亂，在細(xì)胞內(nèi)均勻彌散分布，見圖2B，但數(shù)量較對照組增多，胞核較大;20 mg/L Rh2作用下，細(xì)胞體積增大，但核漿比明顯減小，F(xiàn)－actin 在細(xì)胞內(nèi)分布均勻、規(guī)則，線條清晰，呈長束狀沿細(xì)胞長軸分布，見圖2C，表現(xiàn)出向正常細(xì)胞分化的跡象。

Figure 1. Cell cycle change and apoptosis of SMMC－772 cells after Rh2 treatment examined with flow cytometry.A:control group;B:10 mg/L group ;C:20 mg/L group;D:40 mg/L group;E:statistical graphic of apoptotic rate of SMMC－7721 cells. ±s.n=4. * P ＜0.05 vs 0(control)，10 mg/L and 20 mg/L groups.圖1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率

Figure 2. Morphological changs of F－actin in SMMC－7721 cells treated with Rh2 for 4 days.A:control group(×40);B:10 mg/L group(×40);C:20 mg/L group(×20).圖2 人參皂苷Rh2 誘導(dǎo)SMMC－7721 細(xì)胞F－actin 形態(tài)及分布的改變

4 Rh2 對人肝癌細(xì)胞核基質(zhì)－中間纖維系統(tǒng)的影響

經(jīng)選擇性抽提的細(xì)胞去除了細(xì)胞膜系統(tǒng)、可溶性蛋白及微管、微絲等，但保留下了中間纖維和染色質(zhì)。透射電鏡觀察表明對照組細(xì)胞核基質(zhì)纖維數(shù)量較少、稀薄，分布不均勻;核纖層呈厚薄不一的致密結(jié)構(gòu)，與核纖層連接的核骨架纖維和中間纖維均比較稀疏;中間纖維的單絲成份較少，多見以較粗短的束狀結(jié)構(gòu)存在，排列分布不規(guī)則;經(jīng)人參皂苷Rh2誘導(dǎo)后，SMMC－7721 細(xì)胞核骨架及與核纖層連接的核骨架纖維和中間纖維數(shù)量增多、相互交織;中間纖維單絲數(shù)量明顯增多，向四周發(fā)散直至細(xì)胞邊緣，并轉(zhuǎn)變?yōu)槔w細(xì)、較密的細(xì)絲狀連接尤以20 mg/L 組為明顯，其細(xì)胞核骨架－中間纖維系統(tǒng)中在總體形態(tài)上和正常細(xì)胞較相似，見圖3。

討 論

本研究中MTT 結(jié)果顯示，10 mg/L Rh2即能抑制SMMC－7721 細(xì)胞的生長，第6 d 抑制率為44.3%，而劑量為40 mg/L 時6 d 后的抑制率達(dá)88.3%，表明Rh2對SMMC－7721細(xì)胞的抑制作用具有時間和濃度依賴性;而流式細(xì)胞儀檢測也表明在作用4 d 后，40 mg/L 組的細(xì)胞凋亡率約為31.93%，明顯大于同期空白組、10 mg/L、20 mg/L 組，說明高濃度人參皂苷Rh2對SMMC－7721 細(xì)胞有明顯促凋亡作用，且也呈時間及劑量依賴。因此，隨著Rh2作用時間的延長、濃度的升高，對SMMC－7721 細(xì)胞的抑制及誘導(dǎo)凋亡作用增強(qiáng)。故選取抑制率適中的劑量和作用時間，設(shè)置空白對照組及實驗組(10、20 mg/L Rh2)，均培養(yǎng)4 d，以進(jìn)一步研究Rh2對人肝癌細(xì)胞SMMC－7721 的細(xì)胞骨架的影響。

Figure 3. Morphological changes of the nuclear matrix－intermediate filament system induced by Rh2 at different concentrations. A:control (bar=5 μm);B:10 mg/L group (bar=2 μm);C:20 mg/L group(bar =10 μm);D:20 mg/L group(bar =2 μm).圖3 人參皂苷Rh2 誘導(dǎo)SMMC－7721 細(xì)胞核骨架－中間纖維系統(tǒng)的形態(tài)改變

共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明，Rh2作用于SMMC－7721后可以使其細(xì)胞骨架F－actin 的形態(tài)、分布發(fā)生不同程度的改變。對照組的細(xì)胞微絲顯示紊亂，排列無序，數(shù)量較少且主要在胞膜周邊彌散分布，這可能主要與肌動蛋白側(cè)重于細(xì)胞的爬行擴(kuò)散和遷移有關(guān)［5，6］;當(dāng)Rh2濃度為10 mg/L 誘導(dǎo)細(xì)胞4 d 后，胞質(zhì)中F－actin 分布增多并呈彌散分布;20 mg/L 的Rh2作用4 d 后，胞內(nèi)F－actin 分布均勻、規(guī)則，單絲線條清晰，呈長束狀極性分布，與正常細(xì)胞內(nèi)的F－actin 分布較為相似。表明所選濃度的Rh2可以使SMMC－7721 細(xì)胞的肌動蛋白絲分布向正常肝細(xì)胞的模式改變，通過肌動蛋白絲的解聚和重組，最后向接近正常細(xì)胞的微絲分布模式分化。

核基質(zhì)－中間纖維系統(tǒng)是一種細(xì)胞內(nèi)重要結(jié)構(gòu)，其組分及其構(gòu)型對某些細(xì)胞的增殖和分化具有重要影響，越來越多的研究表明該體系與細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，如核基質(zhì)蛋白Satb2 對Hoxa2 的表達(dá)抑制在成骨細(xì)胞分化過程中扮演了重要的角色［7，8］。近年來，在對惡性腫瘤細(xì)胞的觀察中發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，其核基質(zhì)、核纖層、中間纖維的構(gòu)型與正常細(xì)胞相比具有明顯差異［9］，如其核基質(zhì)具有結(jié)構(gòu)不規(guī)則、畸形等特征。本實驗通過整裝細(xì)胞電鏡技術(shù)，觀察誘導(dǎo)分化前后SMMC－7721 細(xì)胞核基質(zhì)－中間纖維系統(tǒng)發(fā)現(xiàn):對照組細(xì)胞，細(xì)胞核基質(zhì)纖維數(shù)量較少、稀薄，分布不均勻;核纖層呈厚薄不一的致密結(jié)構(gòu)，與核纖層連接的核骨架纖維和中間纖維均比較稀疏;中間纖維的單絲成份較少，多見以較粗短的束狀結(jié)構(gòu)存在，排列分布不規(guī)則，具有惡性腫瘤細(xì)胞核基質(zhì)的構(gòu)型特征;而經(jīng)人參皂苷Rh2誘導(dǎo)后，SMMC－7721 細(xì)胞核骨架及與核纖層連接的核骨架纖維和中間纖維數(shù)量增多、相互交織;中間纖維單絲數(shù)量明顯增多，向四周發(fā)散直至細(xì)胞邊緣并轉(zhuǎn)變?yōu)槔w細(xì)、較密的細(xì)絲狀連接，尤以20 mg/L 組為明顯，其細(xì)胞核骨架－中間纖維系統(tǒng)中在總體形態(tài)上與正常細(xì)胞較相似。這表明Rh2對SMMC－7721 細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的誘導(dǎo)分化作用，細(xì)胞核基質(zhì)的這種向正常構(gòu)型的恢復(fù)現(xiàn)象，是細(xì)胞惡性表型逆轉(zhuǎn)的一種重要形態(tài)特征和功能表現(xiàn)。

本研究表明人參皂苷Rh2能抑制SMMC－7721 細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)其凋亡作用，并呈劑量及時間依賴;同時能誘導(dǎo)SMMC－7721 細(xì)胞向正常肝細(xì)胞分化的作用，其誘導(dǎo)分化的作用機(jī)制可能與通過改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)。但目前有關(guān)從細(xì)胞水平上研究腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞骨架及核基質(zhì)－中間纖維的構(gòu)型變化與癌變的關(guān)系的報道還很少，有待進(jìn)一步實驗研究。

［1］ Yi JS，Choo HJ，Cho BR，et al. Ginsenoside Rh2induces ligand－independent Fas activation via lipid raft disruption［J］. Biochem Biophys Res Commun，2009，385(2):154－159.

［2］ 周桂華，孟 艷.人參單體皂甙Rh2對前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C－3M 細(xì)胞移行周期的影響［J］. 中國病理生理雜志，2002，18(7):823－825.

［3］ Slattery C，Campbell E，McMorrow T，et al.Cyclosporine A－induced renal fibrosis:a role for epithelial－mesenchymal transition［J］.Am J Pathol，2005，167(2):395－407.

［4］ Capco DG，Krochmalnic G，Penman S. A new method of preparing embeddment－free sections for transmission electron microscopy:application to the cytoskeletal framework and other three－dimensional networks［J］. J Cell Biol，1984，98(5):1878－1885.

［5］ Lee YJ，Keng PC. Studying the effects of F－actin cytoskeletal destabilization on cell cycle by cofilin overexpression［J］. Mol Biotechnol，2005，31(1):1－10.

［6］ Yan W，F(xiàn)u Y，Liao J，et al.Effect of focal adhesion kinase on cytoskeletal arrangement of HepG2 cells induced by hypoxia［J］.Chin Ger J Clin Oncol，2009，8(3):129－133.

［7］ Ellies DL ，Krumlauf R. Bone formation:the nuclear matrix reloaded［J］.Cell，2006，125(5):840－842.

［8］ Girard－Reydet C，Grégoire D，Vassetzky Y，et al. DNA replication initiates at domains overlapping with nuclear matrix attachment regions in the xenopus and mouse c－myc promoter［J］. Gene，2004，332:129－138.

［9］ Alderts B，Johnson A，Lewis J. Molecular biology of the cell［M］. 5th ed.New York:Garland Science，2008.1197－1204.