張 晶， 戚仁斌， 汪志剛， 趙彥儒， 王華東， 陸大祥

(暨南大學醫(yī)學院病理生理學系，暨南大學腦科學研究所，國家中藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州510632)

材 料 和 方 法

1 動物與主要試劑

1.1 動物 新生24 h 內(nèi)SD 乳鼠，SPF 級，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK 粵2006－0015。

1.2 主要試劑 遠志皂苷元，購于成都曼斯特生物科技有限公司，純度＞98%。DMEM－F12 培養(yǎng)基、胎牛血清購于Hyclone。Neurobasal 培養(yǎng)基、B27 購于Gibco。四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、Hoechst 33258 購于Sigma。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。Trizol 購于Invitrogen。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega。SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒購于TaKaRa。3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體、Bcl－2、Bax 兔抗大鼠多克隆抗體來自CST。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 來自北京鼎國昌盛生物有限公司。

1.3 主要儀器 微量核酸分光光度計(Thermo scientific)，多功能全波長酶標儀(Tecan)，熒光顯微鏡(Olympus)，梯度PCR 儀(PerkinElmer)，lightcycler 480 實時熒光定量PCR 儀(Roche)，Western blotting蛋白印跡電泳儀和蛋白印跡電轉(zhuǎn)儀(Bio－Rad)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及模型建立 新生24 h 內(nèi)的SD 大鼠，無菌條件下斷頭取腦，分離海馬組織，置于終濃度為0.125%胰酶的PBS 中，快速剪成1 mm×1 mm×1 mm 左右組織塊，37 ℃消化10 min，用含10%胎牛血清的DMEM－F12 培養(yǎng)基終止消化，200 目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，重懸細胞，計數(shù)后以3.5 ×108/L 的密度種于培養(yǎng)板(多聚賴氨酸包被過夜)中，4 h 后全量換為含2%B27 的Neurobasal 培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)至第6 d，經(jīng)MAP2 鑒定神經(jīng)元純度后，用于后續(xù)實驗。實驗分正常組、H2O225 μmol/L、H2O250 μmol/L、H2O275 μmol/L、H2O2100 μmol/L 4 個濃度模型組，培養(yǎng)12 h 后，每孔加入0.5% MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，充分溶解，酶標儀570 nm 波長測定吸光度(absorbance，A)值，檢測細胞存活率。

2.2 Sen 對H2O2損傷的海馬神經(jīng)元的影響

①Sen 對海馬神經(jīng)元存活率的影響 海馬神經(jīng)元接種于96 孔板中，實驗分正常組及Sen 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L 5 個組，培養(yǎng)2 h 和12 h 后，MTT 法檢測細胞存活率，篩選對神經(jīng)元無損傷的藥物濃度。

②Sen 對氧化損傷海馬神經(jīng)元存活率的影響 96 孔板中分別加入20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L Sen，預培養(yǎng)12 h，然后加入終濃度為50 μmol/L 的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，MTT 法檢測細胞存活率。

③MDA、SOD 檢測 細胞分組同②，藥物干預神經(jīng)元后，裂解、收集細胞。取100 μL 收集液按照SOD和MDA 試劑盒說明書操作，測定吸光度值，并用BCA 法對細胞蛋白含量測定。

2.3 Sen 對H2O2損傷的海馬神經(jīng)元的作用機制研究

①Sen 對H2O2損傷的海馬神經(jīng)元凋亡的影響 Hoechst 33258 是一種能夠穿透胞膜，結(jié)合DNA 的藍色熒光染料，常用于細胞凋亡的檢測。海馬神經(jīng)元經(jīng)藥物處理后，棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min，然后PBS 清洗2 次，加入Hoechst 33258 避光染色10 min，倒置顯微鏡下拍照。

②Real－time PCR 檢測bcl－2 和bax 基因表達 實驗分為4 組，正常組、50 μmol/L H2O2組、Sen 20 μmol/L +H2O2組和Sen 20 μmol/L 藥物組。Trizol法提取各組細胞總RNA，然后微量核酸分光光度計分析RNA 濃度和純度。按照Promega 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，取2 μg RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)總體系為25 μL。取逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物cDNA 2 μL 進行PCR 循環(huán)。設置反應為95 ℃10 s，60 ℃10 s，72 ℃10 s，42 個循環(huán)。反應完畢后數(shù)據(jù)采用2－ΔΔCT方法處理。根據(jù)GenBank 序列，采用分子生物學分析軟件Primer 5.0 設計引物，序列如下:bcl－2 上游引物5'－TGAACCGGCATCTGCACAC－3'，下游引物5'－CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG－3'，產(chǎn)物長度116 bp。bax 上游引物5'－AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG－3'，下游引物5'－GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA－3'，產(chǎn)物長度197 bp。GAPDH 上游引物5'－GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG－3'，下游引物5'－ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA－3'，產(chǎn)物長度143 bp。

③Western blotting 檢測Bcl－2 和Bax 蛋白表達 實驗分組同real－time PCR，棄板中培養(yǎng)液，每孔中加入60 μL 細胞裂解液裂解30 min，然后轉(zhuǎn)移到離心管中，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，分裝上清，－80℃保存。蛋白經(jīng)BCA 法定量后，配制SDS 聚丙烯酰胺凝膠，上樣電泳，蛋白電轉(zhuǎn)移，抗體孵育，顯影。結(jié)果以目的條帶與GAPDH 條帶的灰度比值評定蛋白質(zhì)表達相對含量。

④Caspase－3 活性檢測 實驗分組同real－time PCR，室溫下解凍100 ×酶作用物和緩沖稀釋液，渦旋振蕩器混勻酶作用物，用緩沖稀釋液將100 ×酶工作液稀釋至1 ×酶工作液，臨用前配好。按照培養(yǎng)液∶酶工作液=1∶1 比例向96 孔板中加入酶工作液，微量振蕩器振蕩30 s，25 ℃孵育60 min，酶標儀檢測發(fā)光值。

3 統(tǒng)計學處理

SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 模型建立

細胞培養(yǎng)6 d 后，胞體呈梭形或三角形，突起增多、延伸，并且可見突起延伸形成的網(wǎng)絡，經(jīng)MAP－2鑒定后，神經(jīng)元數(shù)目占細胞總數(shù)90%以上，可用于實驗。25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L H2O2作用神經(jīng)元12 h 后發(fā)現(xiàn)，細胞損傷程度與H2O2濃度呈劑量相關(guān)性，MTT 結(jié)果顯示，細胞存活率分別為(95.6 ±11.6)%、(73.1 ±6.8)%、(61.5 ±5.6)%、(58.8±9.5)%，本實驗選擇50 μmol/LH2O2作為細胞造模濃度，見圖1。

Figure 1. Effect of different concentrations of H2O2 on cell viability in hippocampal neurons. ± s. n = 3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.圖1 H2O2 對海馬神經(jīng)元存活率的影響

2 Sen 對海馬神經(jīng)元的影響

2.1 Sen 對海馬神經(jīng)元存活率的影響 不同濃度Sen 與海馬神經(jīng)元共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，培養(yǎng)2 h，Sen 對細胞存活率未見明顯影響，而培養(yǎng)12 h后，Sen 濃度為20 μmol/L 和40 μmol/L 時，細胞存活率分別為(116.3 ±2.7)%和(109.0 ±2.9)%，差異顯著(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2. Effect of different concentrations of Sen on cell viability in hippocampal neurons at different time points. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖2 不同遠志皂苷元濃度和時間對海馬神經(jīng)元存活率的影響

2.2 Sen 對氧化損傷的海馬神經(jīng)元存活率的影響

與正常組相比，H2O2組細胞存活率約為(76.8 ±9.8)%，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L Sen 藥物預處理后，細胞存活率升高，分別為(90.5 ± 8.9)%、(87.8 ±8.1)%、(86.6±7.5)%，差異顯著(P ＜0.05)，見圖3。

Figure 3. Effect of Sen on viability of hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs control(non－treatment);#P ＜0.05 vs H2O2 group.圖3 遠志皂苷元對H2O2 誘導海馬神經(jīng)元損傷的存活率影響

2.3 Sen 對神經(jīng)元胞內(nèi)MDA 含量和SOD 活性的影響 與正常組相比，H2O2組細胞SOD 活性降低，MDA 含量升高，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen 預處理組細胞，SOD 活性提高，MDA 含量降低，差異顯著(P ＜0.05);其它濃度組未見明顯區(qū)別，見表1。

表1 遠志皂苷元對H2O2 誘導的海馬神經(jīng)元內(nèi)SOD 活性和MDA 含量的影響Table 1. Effect of Sen on activity of SOD and content of MDA in hippocampal neurons treated with H2O2(±s.n=3)

表1 遠志皂苷元對H2O2 誘導的海馬神經(jīng)元內(nèi)SOD 活性和MDA 含量的影響Table 1. Effect of Sen on activity of SOD and content of MDA in hippocampal neurons treated with H2O2(±s.n=3)

* P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs H2O2 group.

Group SOD(103U/g protein) MDA(μmol/g protein)Control 26.72±2.08 1.48±0.09 H2O2 50 μmol/L 13.10±0.95* 2.70±0.26*H2O2+Sen 20 μmol/L 19.60±3.95# 1.99±0.15#H2O2+Sen 30 μmol/L 18.80±1.68 2.31±0.10 H2O2+Sen 40 μmol/L 18.61±2.04 2.38±0.16

3 凋亡相關(guān)檢測結(jié)果

3.1 Hoechst 33258 染色形態(tài)觀察 Hoechst 33258細胞核染色后拍照，圖4A 示正常組，細胞核呈現(xiàn)均勻低強度熒光，見少量高亮濃染的凋亡形態(tài)細胞;圖4B 示H2O2組，見大量細胞核濃染、高亮固縮，凋亡特征的細胞多于正常組;圖4C 示20 μmol/L Sen +H2O2組，高亮藍染的凋亡形態(tài)細胞比H2O2組少;圖4D 示Sen 單獨處理細胞組，凋亡特征形態(tài)的細胞數(shù)與正常組相比，未見明顯差別。

Figure 4. Morphological changes of nucleus of apoptotic hippocampal neurons shown by Hoechst 33258 staining. The apoptotic cells are indicated by arrows (×200).A:control group;B:H2O2 50 μmol/L group;C:H2O2 +Sen 20 μmol/L group;D:Sen 20 μmol/L group.圖4 遠志皂苷元對H2O2 誘導的海馬神經(jīng)元損傷形態(tài)的影響

3.2 bcl－2 mRNA 表達 Real－time PCR 結(jié)果顯示，與正常組相比，H2O2組抗凋亡基因bcl－2 表達下調(diào)，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen+H2O2組bcl－2 mRNA 表達升高，差異顯著(P ＜0.05);Sen 單獨處理組與正常組未見明顯差異，見圖5。

Figure 5. Effect of Sen on the expression of bcl－2 mRNA in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s. n=4. #P ＜0.05 vs control (non－treatment)* P ＜0.05 vs H2O2 group.圖5 遠志皂苷元對H2O2 誘導海馬神經(jīng)元bcl－2 mRNA 表達的影響

3.3 bax mRNA 表達 Real－time PCR 結(jié)果顯示，與正常組相比，H2O2組bax表達下調(diào)，差異顯著(P＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen +H2O2組bax mRNA 表達升高，差異顯著(P ＜0.05);Sen 單獨處理組與正常組未見明顯差異，見圖6。

Figure 6. Effect of Sen on the expression of bax mRNA in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n=3. #P ＜0.05 vs control(non－treatment);* P ＜0.05 vs H2O2 group.圖6 遠志皂苷元對H2O2 誘導的海馬神經(jīng)元內(nèi)bax mRNA表達的影響

3.4 Bcl－2 蛋白表達 Western blotting 結(jié)果顯示，與正常組相比，H2O2組Bcl－2 蛋白表達下降，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen +H2O2組Bcl－2 表達升高，差異顯著(P ＜0.05);與正常組相比，Sen 單獨處理組Bcl－2 表達升高，差異顯著(P ＜0.05)，見圖7。

3.5 Bax 蛋白表達 Western blotting 結(jié)果顯示，與正常組相比，H2O2組Bax 蛋白表達上調(diào)，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen+H2O2組Bax 表達下降，差異顯著(P ＜0.05)，見圖8。

3.6 Sen 對caspase－3 活性的影響 與正常組相比，H2O2組caspase－3 活性升高，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen+ H2O2組細胞caspase－3 活性降低，差異顯著(P ＜0.05)，見圖9。

Figure 7. Effect of Sen on the expression of Bcl－2 protein in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n=3. *P ＜0.05 vs control (non－treatment);#P ＜0.05 vs H2O2 group.圖7 遠志皂苷元對H2O2 誘導的海馬神經(jīng)元內(nèi)Bcl－2 蛋白表達的影響

Figure 8. Effect of Sen on the expression of Bax protein in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s. n =3. * P＜0. 05 vs control(non－treatment);#P ＜0. 05 vs H2O2 group.圖8 遠志皂苷元對H2O2 誘導的海馬神經(jīng)元內(nèi)Bax 蛋白表達的影響

Figure 9. Effect of Sen on the activity of caspase－3 in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n =3. #P ＜0.05 vs control(non－treatment);* P ＜0.05 vs H2O2 group.圖9 遠志皂苷元對H2O2 誘導的海馬神經(jīng)元caspase－3 活性的影響

討 論

近年來研究表明，ROS 引起的氧化應激與神經(jīng)退行性疾病有密切聯(lián)系，這與神經(jīng)元需氧和耗氧高于機體內(nèi)其它類型細胞有關(guān)，因此，神經(jīng)元受到ROS攻擊時，更容易產(chǎn)生氧化應激損傷。Ma 等［7］發(fā)現(xiàn)提高線粒體內(nèi)SOD 活性，可以改善由于氧化應激引起的AD 模型小鼠Tg2576 小鼠記憶障礙;在快速老化小鼠SAMP10 的海馬研究中發(fā)現(xiàn)，其神經(jīng)元線粒體SOD 活性明顯低于正常小鼠，而MDA 含量則高于正常小鼠(P ＜0.01)，說明其在其海馬組織中的自由基含量有所增高，亦提示氧化應激損傷可能是AD 發(fā)生的重要因素之一［8］。Whittemore 等［9］通過H2O2誘導大鼠皮層神經(jīng)元損傷，對細胞進行特異DNA 染色以及DNA ladder 檢測，發(fā)現(xiàn)H2O2可能介導了Aβ 誘導的神經(jīng)元凋亡;Hensley 等［10］運用水楊酸羥化法也證實在無細胞的Aβ(25－35)培養(yǎng)液中能夠產(chǎn)生活性氧，而且氧化作用敏感的酶失活，如谷氨酰胺合成酶。此外，還有研究表明Aβ 可以通過ROS 氧化作用加重對神經(jīng)細胞的損傷，增強細胞因子引起的炎癥反應［1］。因此，氧化應激是AD 發(fā)病中的重要因素之一，也基于這個原因，從氧化應激多個環(huán)節(jié)來研究AD 發(fā)病機制和防治措施逐漸成為共識。

本室先前自擬中藥Q0409 組方［4］和抗衰益智方Ⅰ［5］(主要成分為遠志)可以改善SAMP－8 小鼠、東莨菪堿所致記憶障礙小鼠和自然衰老記憶障礙小鼠的學習記憶能力，并且能提高正常小鼠腦內(nèi)乙酰膽堿含量，從而提高正常小鼠的學習記憶能力。為了進一步探討Q0409 組方和抗衰益智方Ⅰ抗AD 機制，我們在此研究基礎上，選擇上述組方的主要單體成分之一遠志皂苷元進行深入研究。已有的研究發(fā)現(xiàn)遠志皂苷元具有一定的抗氧化損傷的作用，如田楓等［11］研究遠志皂苷元能顯著提高快速老化癡呆模型小鼠SAMP/8 腦組織總蛋白含量、總抗氧化能力和促進蛋白質(zhì)和核酸的合成，孫桂波等［12］觀察遠志皂苷對H2O2誘導PC12 細胞損傷的作用，結(jié)果顯示其能夠明顯改善細胞存活率，LDH 漏出量、MDA 含量降低，SOD 活性升高(P ＜0.01)。

本研究采用H2O2誘導的神經(jīng)元氧化損傷模型，觀察遠志皂苷元對其作用并探討機制，實驗證實，50 μmol/L H2O2作用于海馬神經(jīng)元12 h 即可造成細胞氧化損傷，神經(jīng)元存活率下降，SOD 活性降低，MDA 含量升高，而細胞經(jīng)過Sen 預處理后，Sen 劑量與神經(jīng)元存活率具有量效關(guān)系，20 μmol/L Sen 處理后抗氧化能力增強顯著，這與文獻報道皂苷物質(zhì)對氧自由基本身影響較少，而大部分可能提高體內(nèi)SOD 等抗氧化酶活性，從而減輕氧自由基對機體損傷［13］相一致。低濃度H2O2作用于細胞時，可通過影響凋亡信號轉(zhuǎn)導與相關(guān)基因功能，造成細胞凋亡，其中Bcl－2 家族和caspase－3 家族在H2O2誘導的凋亡過程中起重要作用［14－16］。我們通過Hoechst 33258 染色發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H2O2作用后細胞核呈凋亡特征性改變，而20 μmol/L Sen 預處理組較H2O2組凋亡細胞減少，進一步觀察Bcl－2 家族蛋白及caspase－3 表達，結(jié)果證實，與正常組相比，H2O2組Bcl－2 蛋白表達下調(diào)，Bax 蛋白表達上調(diào)，caspase－3 活性升高，而20 μmol/L Sen+ H2O2組，Bcl－2 蛋白表達增加，Bax 蛋白表達下降，caspase－3 活性降低，提示Sen 可能通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白從而抑制細胞凋亡。

綜上所述，遠志皂苷元可以通過提高海馬神經(jīng)元抗氧化酶的活性，抑制H2O2誘導的細胞凋亡，從而起到保護神經(jīng)元的作用，實驗結(jié)果提示遠志皂苷元具有防治AD 的應用前景，該作用機制還有待進一步研究證實。

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