陳培芬， 羅雅玲， 賴文巖， 邢曉雯， 駱子義， 邱智輝

(深圳市第三人民醫(yī)院1 內(nèi)科，5胃鏡室，廣東 深圳518110;南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院2 呼吸科，3心內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510515;4廣州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州510120)

氣道重塑是哮喘具有特征性的病理改變之一。哮喘患者增厚的基底膜層主要是由I、III、V 型膠原纖維和成肌纖維細(xì)胞產(chǎn)生的纖維連接蛋白組成［1］。其中，Ⅲ型膠原的增生也是細(xì)胞外基質(zhì)沉積的主要病理基礎(chǔ)［2］。

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是體內(nèi)一種重要的多功能細(xì)胞因子，具有促炎、免疫調(diào)節(jié)等功能。新近的研究提示MIF 在氣道重塑中起重要作用［3］，但其機(jī)制未明。本研究探討了MIF 在人胚肺成纖維細(xì)胞合成Ⅲ型膠原中可能的作用及其途徑，以初步探討MIF 在氣道重塑中的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;胎牛血清為PAA 產(chǎn)品;recombinant MIF(rMIF)購(gòu)自R＆D;Trizol RNA 抽取試劑為Invitrogen 產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas;鼠抗人Ⅲ型膠原抗體購(gòu)自Santa Cruz;HRP -兔抗鼠IgG(II 抗)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;Rho 激酶抑制劑Y27632 購(gòu)自BioSource;PCR 引物由上海英駿公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人胚肺成纖維細(xì)胞株MRC-5(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清，細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的rMIF(25-100 μg/L)。

2.2 RT-PCR 方法檢測(cè)Ⅲ型膠原mRNA 的表達(dá)

使用6 孔板，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組孵育完成后收集細(xì)胞，用Trizol 提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度。反應(yīng)分2 步進(jìn)行:取5 μL 總RNA，在M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA;取1 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。Ⅲ型膠原上游引物為5'-GCTGGCTACTTCTCGCTCTG-3'，下游引物為5'-AGCAGTTGGAGGCTGTGGG-3'，產(chǎn)物大小257 bp;GAPDH 上游引物為5' - ACCACAGTCCATGCCATCAC -3'，下游引物為5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產(chǎn)物大小450 bp。PCR 反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性5 min，94℃1min，53℃45 s，72℃1 min，進(jìn)行36 個(gè)循環(huán)，最后72℃10 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外透射反射儀觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及亮度并攝影。使用IPP6.0 圖像分析軟件對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行分析，以平均灰度值代表相應(yīng)基因的表達(dá)量，并除以GAPDH 灰度值，所得數(shù)值作為各擴(kuò)增產(chǎn)物mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

2.3 Western blotting 檢測(cè)III 型膠原蛋白表達(dá) 用預(yù)冷PBS 洗細(xì)胞3 次，加入200 μL 蛋白裂解液，刮起細(xì)胞，4 ℃12 000 × g，離心15 min，吸取上清，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。取40μg 的上述樣品加樣至15% SDS-PAGE 凝膠，電泳，待溴酚藍(lán)接近凝膠底部時(shí)停止電泳，用轉(zhuǎn)移緩沖液把凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，加入1∶ 500 稀釋的鼠抗人III 型膠原抗體及β-actin 單克隆抗體，于4℃孵育12 h，然后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，TBST 洗膜后用ECL 液顯影，以β -actin 為內(nèi)參照，用IPP 6.0 圖像分析軟件對(duì)III 型膠原蛋白進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 rMIF 對(duì)MRC－5 細(xì)胞III 型膠原mRNA 轉(zhuǎn)錄的影響

如圖1 所示，rMIF 刺激人MRC -5 細(xì)胞后48 h，呈劑量依賴地促進(jìn)III 型膠原mRNA 表達(dá)(P ＜0.01)。

Figure 1. rMIF induces collagen type III (Col III)mRNA synthesis in MRC-5 fibroblasts. A:an experiment of RT-PCR. Cells were stimulated with DMEM and rMIF at 25 -100 μg/L for 48 h. B:quantity of Col III mRNA expression presented by integrated value. ±s.n=6. ##P ＜0.01 vs control (0 μg/L).圖1 不同濃度rMIF 刺激MRC－5 細(xì)胞III 型膠原mRNA表達(dá)

2 rMIF 對(duì)MRC－5 細(xì)胞III 型膠原蛋白表達(dá)的影響

如圖2 所示，rMIF 刺激人MRC - 5 細(xì)胞后48 h，呈劑量依賴地誘導(dǎo)III 型膠原蛋白表達(dá)(P ＜0.01)。

Figure 2. rMIF induces collagen type III (Col III)protein expression in cells. A:an experiment of Western blotting. Cells were stimulated with DMEM and rMIF at 25 -100 μg/L for 48 h. B:quantity of Col III protein expression presented by integrated value. ± s. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs control(0 μg/L).圖2 不同濃度rMIF 促進(jìn)MRC－5 細(xì)胞III 型膠原蛋白合成

3 拮抗Rho 激酶抑制III 型膠原mRNA 表達(dá)

如圖3 所示，加入Rho 拮抗劑后可顯著抑制rMIF 誘導(dǎo)的III 型膠原mRNA 合成(P ＜0.01)。

4 拮抗Rho 激酶抑制III 型膠原蛋白表達(dá)

如圖4 所示，加入Rho 拮抗劑后可顯著抑制rMIF 誘導(dǎo)的III 型膠原蛋白表達(dá)(P ＜0.01)。

討 論

細(xì)胞因子MIF 具有廣泛的生物學(xué)功能如酶學(xué)功能、免疫調(diào)節(jié)功能。研究表明，MIF 可促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖［4］，刺激血管平滑肌細(xì)胞合成I、III 型膠原mRNA 和I 型膠原蛋白，從而參與高血壓血管重構(gòu)［5］，與動(dòng)脈內(nèi)膜增厚有關(guān)［6］。提示MIF 在細(xì)胞增殖和膠原合成中具有重要作用。哮喘患者M(jìn)IF 表達(dá)增加，是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵因素［7-10］。而且MIF 可能誘導(dǎo)二異氰酸酯哮喘患者肺泡盥洗液中基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9，MMP - 9)表達(dá)［11］，MMP -9 在哮喘氣道重塑中起重要作用。新近的研究也提示MIF 參與氣道重塑［3］，但機(jī)制未明。

Figure 3. Effect of Y27632 on Col III mRNA expression in rMIF-stimulated MRC-5 cells. A:an experiment of RT-PCR. Cells were stimulated with DMEM，rMIF and Y27632 for 48 h. B:quantity of Col III mRNA expression presented by integrated value. ±s.n=6. ＊＊P ＜0.01 vs control.圖3 Y27632 對(duì)rMIF 刺激的MRC－5 細(xì)胞III 型膠原mRNA 表達(dá)的影響

Figure 4. Effect of Y27632 on Col III protein expression in rMIF- stimulated MRC - 5 cells. A:an experiment of Western blotting. Cells were stimulated with DMEM，rMIF and Y27632 for 48 h. B:quantity of Col III protein expression presented by integrated value. ±s. n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 Y27632 對(duì)rMIF 刺激的MRC－5 細(xì)胞III 型膠原蛋白表達(dá)的影響

作為氣道黏膜下的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞之一，成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)B)的增殖和積聚可使氣道壁增厚，管腔狹窄;并且FB 產(chǎn)生的膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維等沉積于基底膜，使氣道壁進(jìn)一步增厚。Ⅲ型膠原的增生成為細(xì)胞外基質(zhì)沉積的主要病理基礎(chǔ)［2］。有研究認(rèn)為Ⅲ型膠原沉積是哮喘開(kāi)始?xì)獾乐厮艿臉?biāo)志［12］。因此我們進(jìn)一步探討了MIF 與Ⅲ型膠原合成之間的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，rMIF 可呈濃度依賴性促進(jìn)Ⅲ型膠原mRNA 和蛋白表達(dá)。這提示MIF 可能通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞Ⅲ型膠原合成而參與哮喘的氣道重塑。這與本研究的前期結(jié)果MIF 可促進(jìn)MRC-5 增殖和I 型膠原合成是一致的［13］。

MIF 導(dǎo)致MRC-5 細(xì)胞膠原表達(dá)增多的機(jī)制尚不清楚。最近發(fā)現(xiàn)，MIF 可激活Rho 激酶途徑［4］，而Rho 激酶在調(diào)控血管緊張素Ⅱ刺激大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖與膠原合成中具有重要作用［14］。大量研究提示Rho 激酶途徑是哮喘氣道重塑中的一條重要通路。Rho 抑制劑可抑制G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein -coupled receptor，GPCR)激動(dòng)劑溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)誘導(dǎo)的人氣道平滑肌細(xì)胞增殖，而且也抑制LPA 與表皮生長(zhǎng)因子的協(xié)同作用［15］。有研究表明1 -磷酸鞘氨醇引起人肺成纖維細(xì)胞WI38 向成肌纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化也是通過(guò)Rho激酶途徑介導(dǎo)的［16］。

Rho 相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho -associated - coiled coil forming protein kinase，ROCK)是Rho 蛋白的下游靶效應(yīng)分子之一。Y27632 是在細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)研究中廣為應(yīng)用的ROCK 抑制劑。本研究在rMIF 刺激MRC -5 細(xì)胞前預(yù)先用Y27632處理，觀察其對(duì)rMIF 促進(jìn)膠原表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，rMIF 誘導(dǎo)MRC-5 細(xì)胞III 型膠原表達(dá)的能力可被Y27632 所抑制。由于Y27632 只特異性作用于Rho 激酶，因此本結(jié)果提示Rho 激酶信號(hào)通路參與了rMIF 誘導(dǎo)的MRC-5 細(xì)胞III 型膠原合成。

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