朱維晃 ,臧 輝 ,吳豐昌 (.西安建筑科技大學(xué),西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室,陜西 西安70055；.中國環(huán)境科學(xué)研究院,國家環(huán)境保護湖泊污染控制重點實驗室,北京 000)

微生物還原針鐵礦膠體的動力學(xué)特征及其影響因素

朱維晃1*,臧 輝1,吳豐昌2(1.西安建筑科技大學(xué),西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點實驗室,陜西 西安710055；2.中國環(huán)境科學(xué)研究院,國家環(huán)境保護湖泊污染控制重點實驗室,北京 100012)

基于典型的希瓦氏金屬還原菌(Shewanella decolorationis S12)和針鐵礦相互作用的現(xiàn)象,探討了電子供體、針鐵礦濃度及氧化還原中介體2-磺酸鈉蒽醌(AQS)對其相互作用的影響.結(jié)果表明, AQS加入使針鐵礦的微生物還原程度得到加強,在添加AQS的0.5mmol/L針鐵礦體系中,厭氧培養(yǎng)38天后,被還原解離出的Fe(II)濃度是未添加AQS的394%.針鐵礦的歸一化還原速率表明,當(dāng)電子供體濃度一定時,隨著針鐵礦濃度增加,針鐵礦的還原酶促反應(yīng)顯著減弱.米氏擬合方程表明,以不同濃度的針鐵礦為底物時, S12菌-針鐵礦相互作用過程的擬合相關(guān)系數(shù)R2分別為0.843(添加AQS)和0.998(未添加AQS),電子轉(zhuǎn)移載體的存在以及底物類型的不同均對Vmax和Km值均有一定程度的影響.在微生物在還原針鐵礦過程中,其還原速率越大,用于 ATP合成所需能量?E值也隨之升高,S12菌和針鐵礦的還原反應(yīng)達到平衡時, Gibbs自由能變化(?Gr)達最大值.

微生物還原；針鐵礦膠體；乳酸鈉；動力學(xué)特征

金屬元素在與微生物相互作用過程中,充當(dāng)電子受體的角色已被相關(guān)實驗研究所證實[1-2].在金屬-微生物相互作用過程中,高價態(tài)金屬及其氧化物作為電子受體的角色而發(fā)生的“異化金屬還原”,對維系厭氧微生物繁衍是不可或缺的.微生物還原高價態(tài)的鐵錳氧化物不僅影響重金屬的生物環(huán)境地球化學(xué)循環(huán),同時也影響了有機物污染物、重金屬污染物以及營養(yǎng)物質(zhì)(N,P)在環(huán)境中的歸宿[3-5].在異養(yǎng)型金屬還原過程中,有機物作為電子供體,在失去電子的過程中被氧化而得到降解[6-7];充當(dāng)電子受體的金屬得到電子而被還原,故其價態(tài)發(fā)生變化;而不同價態(tài)的金屬離子在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化能力和生態(tài)效應(yīng)是存在差異的,并由此影響污染物的生物地球化學(xué)循

環(huán)[8-10].

就沉積物和土壤中大量存在的鐵錳氧化物而言,一旦鐵錳氧化物被異養(yǎng)型金屬還原菌還原而發(fā)生解離,原本結(jié)合在其上的有機和重金屬污染物就會釋放到環(huán)境中,從而造成潛在的污染危害,故闡明微生物對鐵氧化物及水合物還原作用的機制是必要的[11-13].本研究基于此,以典型的金屬還原菌-希瓦氏金屬還原菌(Shewanella decolorationis S12)與沉積物和土壤中廣泛存在的針鐵礦(α-FeOOH),構(gòu)建鐵還原菌-針鐵礦相互作用體系,探討了微生物異化還原鐵氧化物的動力學(xué)特征及其影響因素,以期為后續(xù)擬揭示在微生物驅(qū)動下,氧化還原敏感性元素鐵和錳參與的“微生物-鐵錳-污染物”耦合的環(huán)境地球化學(xué)循環(huán)特征和規(guī)律提供初步的研究思路和理論支持.

1 材料與方法

1.1 針鐵礦的制備

配制 1.0mol/L的 Fe(NO3)3100mL溶液和4.5mol/L的KOH溶液200mL.在劇烈攪拌情況下,將KOH溶液快速加入到FeCl3溶液中,并迅速把混合溶液稀釋到 1L.將稀釋的溶液在 70℃水浴中恒溫反應(yīng)60h,在反應(yīng)過程中,攪拌反應(yīng)液3-5次,水浴反應(yīng)得到黃褐色沉淀.60h后,用漏斗過濾、洗滌至濾出液的pH值呈中性; 將洗滌后的沉淀用去離子水稀釋定容為500mL的膠體懸浮液[14].

1.2 菌種,培養(yǎng)基及實驗方案

希瓦氏菌 S12[15-16]由廣東省微生物研究所提供.該菌具有利用高價態(tài)金屬氧化物和有機污染物作為電子受體進行厭氧呼吸能力.S12菌與α-FeOOH相互作用體系的成分,包括不同濃度的乳酸鈉、2-磺酸鈉蒽醌 (AQS)、α-FeOOH以及 0.15mmol/L的 HIPES緩沖溶液(pH7.2).在32℃的 LB培養(yǎng)基中好氧培養(yǎng) 12h后,菌體經(jīng)5000r/min離心 5min,無菌超純水洗滌重懸浮,此操作重復(fù)3次,最終配成一定濃度的菌懸液,按體積比為 2%比例將菌體接種于反應(yīng)體系中.反應(yīng)體系分裝于 25mL的西林瓶中,用高純氮充氣排氧,然后用橡膠塞壓緊,置于厭氧培養(yǎng)箱(SHELLAB-Bactron III)中于32℃靜置培養(yǎng).每隔一定時間間隔取樣,測定上清液中針鐵礦被還原而生成的 Fe(II)濃度,Fe(II)濃度分析測試方法見文獻[17].

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度針鐵礦膠體下的微生物還原特征

各不同濃度(0.5,2.0,10.0,50.0mmol/L)的針鐵礦懸液體系中,乳酸鈉濃度為20mmol/L, AQS為 0.1mmol/L.蒽醌類磺酸鹽能作為電子轉(zhuǎn)移載體,即氧化還原中介體,使得電子在微生物與金屬氧化物之間能發(fā)生高效的傳遞,從而促進異化還原過程[18-19].為考察添加電子轉(zhuǎn)移載體對S12菌還原針鐵礦的影響,本實驗用0.1mmol/L 的AQS.添加AQS后,不同濃度的針鐵礦的還原程度得到較為明顯的加強(圖 1),特別是在低濃度(0.5mmol/L)的針鐵礦體系中,反應(yīng)經(jīng)38d后,如在添加AQS的0.5mmol/L針鐵礦體系中,被還原解離出的Fe(II)濃度是未添加AQS的394%.

較高濃度(10.0,50.0mmol/L)的針鐵礦體系中,添加和未添加AQS前后,Fe(II)濃度差別程度沒有低濃度針鐵礦體系中明顯. 首先,針鐵礦濃度上升,相互聚集效應(yīng)加強,膠體顆粒增加,使得微生物-針鐵礦相互接觸難易程度減弱,AQS作為電子轉(zhuǎn)移載體角色在針鐵礦還原過程中的促進作用得到一定程度的減弱;其次,Fe(II)可作為AQS向AH2QS(2-磺酸鈉蒽二酚)轉(zhuǎn)變過程中的還原劑[20],使得針鐵礦在被還原過程中生成的Fe(II)濃度增幅減弱.因為存在醌式結(jié)構(gòu)的 AQS向含酚官能團結(jié)構(gòu)的AH2QS轉(zhuǎn)變,使得分子的共軛效應(yīng)增強[21],故實驗中,明顯可觀察到反應(yīng)體系由無色變漸變?yōu)槌赛S色.在 0～7d的時間內(nèi),不同濃度的針鐵礦受到 S12菌還原而解離出的Fe(II)濃度大致呈線性增加,7d后,Fe(II)濃度隨時間變化程度減弱,并達到穩(wěn)定的峰值,顯示出明顯的酶促反應(yīng)特征.

圖1 S12菌還原不同濃度的針鐵礦過程中Fe(II)濃度的變化Fig.1 The Fe(II) concentration during the microbial reduction of different content goethite

2.2 不同濃度的電子供體對針鐵礦微生物還原特征的影響

考察各不同濃度(0.5,2.0,10.0,20.0mmol/L)的乳酸鈉對針鐵礦還原特征影響時,針鐵礦懸液濃度為40mmol/L,其他成分及濃度同2.1節(jié).添加電子轉(zhuǎn)移載體AQS后,各濃度針鐵礦和S12菌相互作用程度得到加強,針鐵礦生物可利用性程度(可還原率),分別增加了 83.00%,43.94%,67.87%和83.84%(圖2);Fe(II)濃度峰值的出現(xiàn)比無AQS體系經(jīng)歷的反應(yīng)時間長,即表明了 AQS的添加,使得針鐵礦還原反應(yīng)得到進一步的加強.

2.3 微生物-針鐵礦相互作用的動力學(xué)特征

各酶促反應(yīng)下的針鐵礦歸一化還原速率表明(圖3),當(dāng)乳酸鈉濃度為一恒定值時(20mmol/L),隨著針鐵礦濃度增加,還原速率減小.隨著針鐵礦濃度增加,反應(yīng)體系可見有聚集現(xiàn)象發(fā)生,比表面積減小,對菌體的吸附能力減弱,微生物和針鐵礦表明得不到有效的接觸,故針鐵礦的酶促反應(yīng)得到顯著減弱.

乳酸鈉作為電子供體條件下,針鐵礦的還原作用可用式(1)表示:

由式(1)的化學(xué)計量系數(shù)比,結(jié)合圖2,可知該體系中,乳酸鈉濃度超過0.5mmol/L時,電子供體濃度即達到飽和,故當(dāng)乳酸鈉濃度為2mmol/L時,還原反應(yīng)相對于乳酸鈉而言,可視為零級反應(yīng),其濃度對反應(yīng)速率的影響比其在低濃度條件下要微弱的多.故在針鐵礦濃度為 40mmol/L定值時,針鐵礦的歸一化還原速率隨著乳酸鈉濃度增加而增加,且在乳酸鈉濃度大于2mmol/L以后,還原速率增加程度減弱(圖 3).圖 3還表明:在添加AQS后,不同濃度的電子供體(乳酸鈉)以及不同濃度的針鐵礦體系中,針鐵礦的歸一化還原速率均高于未添加AQS條件下.這和Fe(II)濃度隨時間變化的趨勢類似(圖1、圖2),再次驗證了AQS等氧化還原中介體對微生物-鐵氧化物相互作用過程中的促進效應(yīng).

圖2 乳酸鈉濃度對S12菌還原針鐵礦的影響Fig.2 The Fe(II) concentration during the microbial reduction of goethite in different content of lactate

圖3 乳酸鈉和針鐵礦濃度對針鐵礦歸一化還原速率的影響Fig.3 the effect of concentration of lactate and goethite on the normalized microbial reduction rate

微生物參與的針鐵礦還原反應(yīng)可用米氏方程來描述,它表示一個酶促反應(yīng)的起始速度(V)與底物濃度(S)關(guān)系的方程,米氏方程形式如下:

式中: Vmax為酶被底物飽和時的反應(yīng)速度;Km值稱為米氏常數(shù).分別以針鐵礦和乳酸鈉為底物,考察了針鐵礦的微生物還原反應(yīng)特征,并用米氏方程進行了擬合,結(jié)果見圖4.米氏方程擬合結(jié)果表明:添加 AQS時,不同的底物(針鐵礦,乳酸鈉)所對應(yīng)的 Vmax幾乎相等,約為0.3d-1左右(表1);而未添加 AQS時,以針鐵礦作為底物條件下的Vmax大于以乳酸鈉為底物條件下的Vmax,即表明S12菌有明顯的以鐵氧化物為電子受體的厭氧呼吸特征.添加AQS后,微生物和針鐵礦之間的相互作用更易進行,其良好的電子轉(zhuǎn)移載體的作用使得底物性質(zhì)差異對Vmax的制約作用不再明顯,Vmax值相差無幾.Km可以反映酶與底物親和力的大小,Km值越小,其親和力越大[22].Km在添加AQS后顯著降低,這表明 AQS的加入,使得 S12菌-針鐵礦之間的親和程度加強,電子在微生物-針鐵礦之間的傳遞更易進行,促進了反應(yīng)的進行,故該條件下的 Vmax比未添加 AQS的要大.

表1 針鐵礦還原的米氏方程擬合結(jié)果Table 1 The fitted parameters of the Michaelis-Menten Equation

圖4 S12菌還原針鐵礦過程中的米氏方程擬合Fig.4 The reduction of the Michaelis-Menten Equation fitted type

根據(jù)式(1),針鐵礦還原過程中的Gibbs自由能變化(?Gr)可用式(3)表示:

微生物厭氧呼吸時所產(chǎn)生的能量一部分用于三磷酸腺苷 (ATP)的合成,以維持代謝的正常進行,假設(shè)ATP合成所需能量為?E,則在S12菌參與下的針鐵礦還原過程中的 Gibbs自由能變化(?Gr')為式(4):

表2 不同底物條件下反應(yīng)體系的?E(kJ/mol)Table 2 The ?E values in conditions of different concentration of substrate (kJ/mol)

圖5 S12菌還原針鐵礦反應(yīng)過程中的Gibbs自由能變化Fig.5 The Gibbs free energy during the microbial reduction of goethite

未接種體系中的被還原而解離的Fe(II)濃度未檢測出,均接近或低于檢測限,這主要是針鐵礦為難溶物(Ksp=10-44),故未接種的針鐵礦和乳酸鈉體系,在熱力學(xué)上是穩(wěn)定的,在室溫下幾乎不能進行([FeOH+]≈0).接種后的體系,可明顯觀察到針鐵礦的還原解離現(xiàn)象(圖1,圖2),微生物的參與使得式(1)的活化能降低,使針鐵礦還原反應(yīng)得以進行,當(dāng)式(1)達到平衡時,即 ?Gr'= ? Gr+?E =0,故? E=-? Gr,說明反應(yīng)體系必須提供?E的最低能量以維持ATP的合成,使得微生物還原針鐵礦的過程得以維持.由反應(yīng)體系中各反應(yīng)物和產(chǎn)物其在標(biāo)準(zhǔn)狀況下的?,可得?,由式(3),并根據(jù)反應(yīng)體系中各反應(yīng)物和產(chǎn)物的濃度,可計算出體系經(jīng)歷不同反應(yīng)時間所對應(yīng)的?Gr,結(jié)果見圖5.式(1)平衡時,由 ? E=-? Gr可知不同體系中所需的?E(表 2).在以針鐵礦充當(dāng)?shù)孜锏捏w系中,?E隨著針鐵礦濃度減小而增加,由針鐵礦濃度和針鐵礦歸一化還原速率之間的關(guān)系(圖3)可知,針鐵礦濃度在較低的情況下,其S12菌對針鐵礦的還原速率快,微生物活動參與程度越高,用來合成ATP所需的能量也隨之上升.而隨著乳酸鈉濃度越高,針鐵礦的歸一化還原速率逐漸增加(圖 3),在其過程的?E也隨之增加,當(dāng)乳酸鈉濃度大于 2.0mmol/L,還原速率增加程度減弱(圖3),?E值變化已不明顯(圖 5).未添加 AQS后的反應(yīng)體系,不論底物的類型何如,其?E均比添加AQS條件下的高,這驗證了類似的結(jié)論:即 AQS等氧化還原中介體的缺失,使得電子在S12菌和針鐵礦表面?zhèn)鬟f變得困難,需要更多的?E用來合成ATP,使微生物還原反應(yīng)過程得以有效進行.

3 結(jié)論

3.1 氧化還原中介體 AQS的加入,使得針鐵礦的微生物還原程度加劇.反應(yīng)經(jīng)38d后,乳酸鈉濃度為20m mol/L時,在添加AQS的0.5mmol/L針鐵礦體系中,被還原解離出的 Fe(II)濃度是無AQS體系中的 394%.當(dāng)針鐵礦懸液濃度為40mmol/L時,不同濃度(0.5,2.0,10.0,20.0mmol/L)乳酸鈉條件下,添加電子轉(zhuǎn)移載體 AQS后,針鐵礦的還原率分別增加了 83.00%,43.94%,67.87%和83.84%.

3.2 當(dāng)乳酸鈉濃度一定時,隨著針鐵礦濃度增加,針鐵礦的歸一化還原速率得到顯著減弱.隨著乳酸鈉濃度的升高,針鐵礦的歸一化還原速率也隨之上升.以針鐵礦為底物時,未添加AQS時,S12菌-針鐵礦相互作用的米氏方程擬合相關(guān)系數(shù)R2可達 0.998;電子轉(zhuǎn)移載體的存在使得不同底物條件下的Vmax趨于一致,針鐵礦為底物時的Km值大于乳酸鈉為底物的Km值,表明了S12菌與不同底物親合的難易程度.

3.3 對S12菌-針鐵礦相互作用過程中的Gibbs自由能計算結(jié)果表明:在反應(yīng)末期,隨著反應(yīng)速率的減緩,?Gr值也趨于平穩(wěn);S12菌以針鐵礦為電子受體進行厭氧呼吸時,針鐵礦的還原速率越大,用于ATP合成所需?E值也隨之升高;體系中未加AQS時, S12菌對針鐵礦的還原程度降低,需要更多的?E用來合成 ATP,使微生物還原反應(yīng)過程得以有效進行,從而使得?E值升高.

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The kinetic characteristics of the microbial reduction of goethite.

ZHU Wei-huang1*, ZANG Hui1, WU Feng-chang2(1.Key Laboratory of Northwest Water Resources, Environment and Ecology, Ministry of Education, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi’an 710055, China；2. State Environmental Protection Key Laboratory for Lake Pollution Control, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China). China Environmental Science, 2011,31(5)：820～827

Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) oxide reduction by microorganisms has an important influence on the geochemistry and fate of organic or metal contaminants in environments. To explore the kinetic characteristics of the microbial reduction of Fe(III) and Mn(IV) oxide is the key to understand the mechanism of the interaction of“microbial-oxide-contaminants”. The current study mainly discussed the influence of anthraquinone-2-sulfonate (AQS), the concentration of the electron donor and goethite on the reduction of goethite by S12. The results showed the electron shuttle, AQS, could enhance the degree of goethite reduction. After 38 days incubation, the dissolved Fe(II) concentration was as much as 3.94 times of that in the non-AQS addition cell-goethite reaction system. The Michaelis-Menten kinetic model fit calculations showed the significant correlation between the initial reduction rate and the substrate concentration with a correlation coefficient, R2, high enough to 0.998. The electron shuttle, AQS, could have considerable influence on Vmaxand Kmvalues. The more reduction rate raised, the more energy(?E) will be more needed to drive ATP synthesis. When the microbial redox reaction almost kept in balance, the ?G values reached the maximum.

microbial-reduction；goethite；lactate；kinetic characteristics

X172

A

1000-6923(2011)05-0820-08

2010-09-16

國家自然科學(xué)基金資助項目(40903042);教育部博士點新教師科學(xué)基金(20096120120012);中國博士后科學(xué)基金(20080441167);環(huán)境地球化學(xué)國家重點實驗室開放基金(SKLEG8004)

* 責(zé)任作者, 副教授, zhuweihuang@yahoo.com.cn

朱維晃(1977-),男,安徽廬江人,副教授,博士,研究方向為環(huán)境介質(zhì)中鐵錳-污染物相互作用.發(fā)表論文20余篇.