劉芙蓉 李彥姝 張紅艷 蘇楠 李豐

SCG10基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白表達(dá)和定位

劉芙蓉 李彥姝 張紅艷 蘇楠 李豐＊

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,細(xì)胞生物學(xué)教研室,遼寧沈陽(yáng)110001)

目的 構(gòu)建SCG10真核表達(dá)載體并證實(shí)融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及定位。方法 以人胎腦cDNA文庫(kù)為模板,PCR擴(kuò)增SCG10全長(zhǎng)編碼基因,亞克隆至p EGFP-C1表達(dá)載體中。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒測(cè)序并轉(zhuǎn)染到人胚腎 HEK293中,提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察p EGFP-SCG10在 HEK293細(xì)胞內(nèi)定位。結(jié)果SCG10全長(zhǎng)基因序列克隆到了真核表達(dá)載體p EGFP-C1中,酶切鑒定片段大小540bp。Western blot檢測(cè)到了融合蛋白表達(dá),分子量約為48kD。p EGFP-SCG10在細(xì)胞內(nèi)定位以細(xì)胞漿為主,在細(xì)胞核少量表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建了SCG10全長(zhǎng)基因真核表達(dá)載體,p EGFP-SCG10蛋白主要定位于 HEK293細(xì)胞漿內(nèi)。

SCG10; Western blot; 質(zhì)粒構(gòu)建

SCG10(Superior cervical ganglion-10)是磷酸化蛋白stathmin家族成員之一,在腦組織發(fā)育[1]、微管運(yùn)動(dòng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中均有重要的作用,在神經(jīng)元生長(zhǎng)和骨形成中也有調(diào)節(jié)作用。SCG10也稱stathmin2,是特異的神經(jīng)元標(biāo)志蛋白和潛在的微管失穩(wěn)因子[2]。雖然在成人腦組織中SCG10的表達(dá)水平低,但在發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中SCG10高度表達(dá)。

SCG10編碼序列全長(zhǎng)561bp,187個(gè)氨基酸,N-末端的定向序列調(diào)節(jié)它向軸突和樹(shù)突生長(zhǎng)點(diǎn)的運(yùn)輸,主要蓄積于生長(zhǎng)錐中心區(qū)域(該區(qū)域含大量動(dòng)態(tài)微管)。SCG10是通過(guò)神經(jīng)元生長(zhǎng)錐的微管失衡活化來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)的主要調(diào)節(jié)子,能增加軸突和樹(shù)突頂端的能動(dòng)結(jié)構(gòu)。軸突的延伸、分支和生長(zhǎng)錐的伸展是隨細(xì)胞骨架蛋白連續(xù)重組來(lái)完成的,其中微管是重要的組成部分。生長(zhǎng)錐的微管末端隨α-和β-微管蛋白異二聚體的聚合或解聚而持續(xù)的延伸或縮短[3]。SCG10通過(guò)分離αβ-微管蛋白異二聚體增加微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性,從而降低聚合程度、增加突變頻率反應(yīng)和解聚微管[4]。

本實(shí)驗(yàn)旨在獲得SCG10全長(zhǎng)基因序列及其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位,為進(jìn)一步探討它的生物學(xué)效應(yīng)打下基礎(chǔ)。

材料和方法

1.菌株、細(xì)胞、質(zhì)粒及主要試劑

大腸桿菌DH5感受態(tài)為本實(shí)驗(yàn)室制備;HEK 293人胚腎細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒p EGFPC1(Clontech);PryobestTMDNA polymerase、dNTP、DNA電泳凝膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、限制性核酸內(nèi)切酶 Eco R I和Bam H I(大連 Ta Ka-Ra);TRIzol RNA提取試劑(Invitrogen);DNA marker、Protein marker(GenScript);T4DNA 連接酶(NEB);anti-GFP抗體(GenScript);HRP標(biāo)記的羊抗鼠 Ig G(Promega);引物合成、DNA序列測(cè)定由上海英俊生物有限公司完成;ECL發(fā)光試劑盒(Pharmacia);其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.SCG10全長(zhǎng)基因擴(kuò)增

設(shè)計(jì)SCG10擴(kuò)增的 PCR引物,并在引物中加入了 Eco R I和Bam H I兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。上游 SCG10引物為 5’-GCACA TGAA TTCAA TGGCTAAAACA GCA-3’,下游 SCG10 引物為 5’-GCA GCA GGA TCCTCA TTGCTTCTCTCC-3’。以人胎腦cDNA文庫(kù)為模板PCR擴(kuò)增SCG10全長(zhǎng)編碼序列。

3.p EGFP-SCG10表達(dá)載體的構(gòu)建和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

將p EGFP-C1載體和SCG10 PCR片段分別用Eco R I和Bam H I雙酶切后,凝膠回收純化產(chǎn)物。將兩個(gè)片段用 T4DNA連接酶常溫連接2h,取5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆菌落,接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩過(guò)夜。用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,用 Eco R I和Bam H I雙酶切鑒定外源基因的插入,進(jìn)行測(cè)序分析。

HEK 293細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞鋪于六孔板至70-80%融合,按Invitrogen公司提供的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染六孔板的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

4.蛋白質(zhì)提取與Western blot鑒定

轉(zhuǎn)染48h后,棄掉培養(yǎng)基,用 PBS清洗兩遍。在細(xì)胞中加入60μl含有蛋白酶抑制劑的 RIPA裂解液,用橡皮刮刀將細(xì)胞緩慢刮下。收集所有液體到新的離心管中,冰上放置 10min,裂解細(xì)胞。13 000×g 4℃離心30min,將上清轉(zhuǎn)到新的離心管中,取上清5μl進(jìn)行定量。

將蛋白定量后,取 40μg總蛋白經(jīng) 10%SDSPA GE凝膠分離,4℃過(guò)夜恒壓轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉3h,TBST洗膜15min,3次。用anti-GFP抗體(1∶500稀釋),4℃過(guò)夜,TBST洗膜15min,3次。再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠(1∶5000稀釋)二抗孵育 1h,TBST洗膜 15min,3次。ECL顯色,壓片。

5.共聚焦激光掃描顯微鏡觀察p EGFP-SCG10細(xì)胞內(nèi)定位

將構(gòu)建的綠色熒光蛋白表達(dá)載體p EGFPSCG10轉(zhuǎn)染到 HEK 293細(xì)胞24h后,應(yīng)用OL YMPUS FV 1000S-SIM/IX81激光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行掃描,激發(fā)光波長(zhǎng)為 488nm,可看到 GFPSCG10蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位處呈現(xiàn)綠色。

結(jié) 果

1.人SCG10基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增

以人胎腦cDNA文庫(kù)為模板,特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增 SCG10全長(zhǎng)。擴(kuò)增的條件為95℃5min預(yù)變性;95℃1min,55℃1min,72℃1min此三個(gè)溫度進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃10min,溫度降至4℃。1%水平瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶染色后,在紫外燈下觀察結(jié)果(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增出的 SCG10的全長(zhǎng)序列.1.PCR DNA Marker;2,3.SCG10 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCRamplificationof thefull length SCG10.Lane1:PCRDNA Marker;Lane 2,Lane 3:PCRproductsof SCG10

2.SCG10重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將重組質(zhì)粒 p EGFP-SCG10經(jīng) Eco R I和Bam H I雙酶切后得到了約4.7 kb和540bp左右的兩條帶(圖2)。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析,外源序列在NCBIBlast比對(duì)結(jié)果與SCG10編碼序列一致。

圖2 對(duì)融合質(zhì)粒p EGFP-SCG10進(jìn)行限制性酶切分析.1.PCR DNA Marker;2.Eco R I和Bam H I對(duì)融合質(zhì)粒p EGFP-SCG10進(jìn)行酶切鑒定;3,4.p EGFP-C1質(zhì)粒;5.Lambda DNA/Eco RI+HindⅢMarkerFig.2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid p EGFP-SCG10.Lane 1:PCR DNA Marker;Lane 2:Recombinant plasmid p EGFP-SCG10 digested by Eco R I和Bam H I;Lane 3,Lane4:p EGFP-C1 vectors;Lane 5:Lambda DNA/Eco RI+HindⅢMarker

3.真核表達(dá)質(zhì)粒在 HEK 293細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒p EGFP-SCG10轉(zhuǎn)染到HEK 293人胚腎細(xì)胞系中,48h以后將提取的蛋白經(jīng)10%SDS-PA GE凝膠電泳,Western blot檢測(cè)到了融合綠色熒光蛋白 GFP的SCG10蛋白表達(dá)(圖3)。分子量約48kD,為質(zhì)粒本身的 GFP標(biāo)簽分子量(27kD)和SCG10分子量(21kD)之和,說(shuō)明融合蛋白表達(dá)。

圖3 用α-GFP鼠的單克隆抗體對(duì)融合蛋白 GFPSCG10的表達(dá)進(jìn)行 Western blot檢測(cè).1.轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞的 GFP蛋白;2.轉(zhuǎn)染 GFP-SCG10的融合蛋白Fig.3 Western blot analysis of GFP-SCG10 f usion protein using anti-α-GFP mAB.Lane 1:HEK293 cells with GFP-control protein;Lane 2:The fusion protein of GFPSCG10

4.GFP-SCG10在細(xì)胞內(nèi)的定位

通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡觀察到 GFP-SCG10在細(xì)胞內(nèi)定位以漿為主,細(xì)胞核內(nèi)少量表達(dá)(圖4)。

圖4 GFP-SCG10在 HEK293細(xì)胞內(nèi)定位.A:GFP-SCG10(綠色);B:Topro 3(藍(lán)色);C:圖像疊加Fig.4 The localization of GFP-SCG10 in HEK293 cells.A:GFP-SCG10(green);B:Topro 3(blue);C:mergeof images

討 論

磷酸化蛋白stathmin家族有4個(gè)蛋白分子,主要功能是通過(guò)抑制微管聚合、促進(jìn)微管解聚來(lái)調(diào)節(jié)微管動(dòng)力學(xué)。SCG10作為家族的一員,自身結(jié)構(gòu)上有三個(gè)功能區(qū)域,分別是N末端的膜結(jié)合區(qū)域、中心調(diào)節(jié)區(qū)域和c末端的卷曲螺旋區(qū)域。N末端含有35個(gè)氨基酸,是家族中其他成員所不具有的,對(duì)其在高爾基體定位及在生長(zhǎng)錐的富集起著至關(guān)重要的作用[5]。SCG10有四個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)[6],在體內(nèi)外,各種蛋白激酶能使這些位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。中心調(diào)節(jié)區(qū)域有c AMP依賴蛋白激酶(PKA)催化S50和S97發(fā)生磷酸化,調(diào)節(jié)微管蛋白的解聚。c末端的卷曲螺旋區(qū)域被認(rèn)為是蛋白的相互作用區(qū)域,也是SCG10與微管蛋白和細(xì)胞骨架相互結(jié)合的區(qū)域。SCG10蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中同時(shí)表達(dá)。基因表達(dá)的下降與唐氏綜合征[7]和阿爾茨海默氏病[8]的發(fā)生相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)以SCG10基因的上下游序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性的引物,并在引物中摻入了限制性酶切位點(diǎn)。利用引物從人胎腦cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出了SCG10的全長(zhǎng)基因序列,并將其構(gòu)建到了真核細(xì)胞表達(dá)載體p EGFP-C1中,測(cè)序分析外源基因序列,比對(duì)結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功。將融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 HEK 293細(xì)胞中,Western blot驗(yàn)證融合蛋白在細(xì)胞中表達(dá)。利用共聚焦激光掃描顯微鏡證實(shí),p EGFPSCG10在 HEK 293細(xì)胞內(nèi)定位以細(xì)胞漿為主,在細(xì)胞核內(nèi)少量表達(dá)?；蛉L(zhǎng)的獲得及其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)與定位,為進(jìn)一步研究SCG10的生物學(xué)特性奠定了初步基礎(chǔ)。

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Construction of recombinant plasmid of SCG10 gene and identif ication of
its fusion protein expression and localization

Liu Furong,Li Yanshu,Zhang Hongyan,Su Nan,Li Feng＊
(Department of Cytobiology,Key L aboratory of Cytobiology,Ministry of Public Health,and Key L aboratory of Medical Cytobiology,Ministry of Education,China Medical University,Shenyang 110001,China)

Objective To construct the recombinant plasmid of SCG10 gene and identif y its f usion protein expression and localization.Methods The SCG10 coding sequence was amplified by polymerase chain reaction(PCR),and was subcloned into the p EGFP-C1 vector.After the target region was sequenced,the plasmid was transfected into HEK 293 cell lines.The expression of the recombinant plasmid in HEK 293 cells was proved by Western blot.The localization of p EGFP-SCG10 in HEK 293 was observed by using laser scanning confocal microscopy.Results SCG10 was successf ully constructed into the expressing vector p EGFP-C1.The length of the f ragment was 540bp,identified by restriction enzymes digestion.The expression of GFP-SCG10 f usion protein was detected by Western blot,with a molecular weight of 48kD.The p EGFP-SCG10 protein was mainly localized in the cytoplasm,less in the nucleus.Conclusion The recombinant plasmid was successf ully cloned into the eukaryotic expressing vector.The p EGFP-SCG10 f usion protein was expressed mainly in the cytoplasm.

SCG10; Western blot; Plasmid construction

R329.2 Q257

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.014

2011-02-14

2011-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(30771128;90813038);遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2008T195)

劉芙蓉,女 (1967年),漢族,學(xué)士。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)