曹鴻遠(yuǎn) 王槐堂

湖北省咸寧市結(jié)核病防治所 437100

間接比例法檢測(cè)結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗(yàn)影響因素探討＊

曹鴻遠(yuǎn) 王槐堂

湖北省咸寧市結(jié)核病防治所 437100

目的：探討間接比例法檢測(cè)結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗(yàn)的影響因素。方法：通過對(duì)我室2009、2010年兩次參加國(guó)家結(jié)核病參比室組織的結(jié)核桿菌藥物敏感試驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)的結(jié)果進(jìn)行比較與分析,找出影響實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素包括含藥培養(yǎng)基配制的質(zhì)量控制、實(shí)驗(yàn)過程的規(guī)范化、環(huán)境溫度的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、結(jié)果觀察及判斷等等,為以后的實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)支持。結(jié)果：2010年與國(guó)家結(jié)核病參比室的藥敏結(jié)果符合率比2009年有較大的提高。結(jié)論：培養(yǎng)基的質(zhì)量、培養(yǎng)的溫度和操作人員的技術(shù)嫻熟程度均會(huì)影響藥敏試驗(yàn)結(jié)果。關(guān)鍵詞 間接比例法 結(jié)核桿菌 藥物敏感試驗(yàn) 影響因素

結(jié)核桿菌藥物敏感試驗(yàn)的結(jié)果準(zhǔn)確與否是影響第五輪全球基金耐多藥控制項(xiàng)目病人發(fā)現(xiàn)及其治療方案制訂的關(guān)鍵因素。本室于2009年8月和2010年3月兩次參加了國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)活動(dòng),完成了62株(每年31株)結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗(yàn)的檢測(cè)工作?，F(xiàn)將檢測(cè)情況總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 檢測(cè)菌株均由國(guó)家參比室提供,由湖北省參比實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)種后下發(fā)給本室培養(yǎng),第31株為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌H 37Rv敏感株,用以檢測(cè)含藥培養(yǎng)基質(zhì)量。

1.2 藥敏培養(yǎng)基的制備 按湖北省參比實(shí)驗(yàn)室的統(tǒng)一要求配制。含藥培養(yǎng)基分別為 INH/RFP/ SM/EMB,陽性對(duì)照培養(yǎng)基為改良羅氏培養(yǎng)基。對(duì)照培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基配制方法均按照WHO《結(jié)核病控制實(shí)驗(yàn)室工作手冊(cè)(1998)》中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行[1]。2～8℃貯存,3個(gè)月內(nèi)使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)操作 用間接比例法,每份標(biāo)本及每種藥均接種兩支菌量分別為10-2、10-4CFU/管[2]。2009年31株菌株分別于7月14日(10株)、19日(7株)、27日(12株)、31日(2株)四次接種,分別放置于36.5℃兩個(gè)培養(yǎng)箱內(nèi),其中在14、19、31日接種的19株菌株的培養(yǎng)箱溫控器于8月1日18點(diǎn)以后突然失靈,8月2日上午8時(shí)筆者觀察時(shí)箱內(nèi)溫度顯示45℃,維持時(shí)間小于14h,續(xù)將這19株菌株轉(zhuǎn)移至36.5℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),至4周觀察結(jié)果。2010年31株菌株,一次性接種放置于36.5℃培養(yǎng)至4周觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 陽性對(duì)照生長(zhǎng)情況 2009年31株標(biāo)本中,由于有19株標(biāo)本受溫控器失靈導(dǎo)致的短期溫度升高的影響,因而各時(shí)間段接種的標(biāo)本陽性對(duì)照的生長(zhǎng)情況有一定差異：7月7日接種的12株(每株2管,以下同)陽性對(duì)照中有23管生長(zhǎng)良好,其中一株-2濃度未生長(zhǎng),但-4濃度1+;溫控器失靈的培養(yǎng)箱內(nèi)的19株標(biāo)本中,7月14日接種的10株標(biāo)本,陽性對(duì)照生長(zhǎng)的有8株計(jì)14管,兩株-4濃度對(duì)照管未生長(zhǎng);19日接種的7株標(biāo)本中陽性對(duì)照生長(zhǎng)的有2株(其中一株為 H 37Rv敏感株)中的-2濃度管,但只有幾個(gè)菌落,-4濃度管無菌落生長(zhǎng),31日的2例陽性對(duì)照無一生長(zhǎng)。2010年的31株標(biāo)本,陽性對(duì)照中有58管生長(zhǎng)良好,一株-2濃度管未生長(zhǎng),但-4濃度管2+,3株-4濃度管未生長(zhǎng),H 37Rv敏感株陽性對(duì)照生長(zhǎng)良好;兩種濃度陽性對(duì)照菌落生長(zhǎng)融合未顯出明顯濃度差異3例。

2.2 污染情況 2009年檢測(cè)的標(biāo)本中-2濃度管全部污染1例;2010年檢測(cè)的無污染。

2.3 計(jì)算耐藥百分比 若耐藥百分比＞1%則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥,≤1%則為敏感[2]。本文主要統(tǒng)計(jì)與國(guó)家參比室結(jié)果的符合率。由于2009年的31株標(biāo)本陽性對(duì)照生長(zhǎng)的只有22株,因此其藥敏結(jié)果的比較只能以22株來計(jì)算,與國(guó)家參比室的結(jié)果相比符合株數(shù)比依次為INH 18/22、RFP17/22、SM4/22、EMB 5/22;2010年 INH 29/31、RFP28/31、SM26/31、EMB 25/31。

3 討論

3.1 部分陽性對(duì)照未長(zhǎng) (1)溫度的影響。從以上結(jié)果觀察中可看出：在結(jié)核桿菌培養(yǎng)過程中,相對(duì)短期的45℃環(huán)境,對(duì)經(jīng)36.5℃環(huán)境培養(yǎng)時(shí)間在2周以內(nèi)的9株標(biāo)本影響極大,陽性對(duì)照生長(zhǎng)率為2/18,但對(duì)36.5℃環(huán)境培養(yǎng)時(shí)間超過2周的標(biāo)本影響相對(duì)較小,陽性對(duì)照生長(zhǎng)株數(shù)比為16/20。這可能因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌是慢生長(zhǎng)菌,代期較長(zhǎng);此外細(xì)菌的初期生長(zhǎng)有其一定的生長(zhǎng)調(diào)整周期,這一時(shí)期內(nèi)受環(huán)境溫度影響較大。以后細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,短期的溫度略升,對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖影響相對(duì)較小。(2)菌落未磨勻、稀釋不均勻、接種環(huán)挑取了空泡等也是造成部分對(duì)照不生長(zhǎng)的主要原因。

3.2 未顯出明顯濃度差異 配制1mg/m l濃度菌液時(shí)菌量過多,兩濃度陽性對(duì)照培養(yǎng)基的生長(zhǎng)程度均在3+～4+。

3.3 污染 -2濃度全污染1例,且菌落生長(zhǎng)特征相同,經(jīng)革蘭氏染色證實(shí)為真菌污染。本例低濃度培養(yǎng)管未見污染,接種環(huán)境污染應(yīng)可排除,可能首先接種的陽性對(duì)照培養(yǎng)基在貯存過程中被污染但未被發(fā)現(xiàn),后仍經(jīng)依次接種導(dǎo)致本例整個(gè)-2濃度培養(yǎng)基被污染。

3.4 結(jié)果觀察與判斷的難點(diǎn) 通過這兩次測(cè)試,結(jié)合平時(shí)的實(shí)驗(yàn)觀察,發(fā)現(xiàn)：(1)少數(shù)菌株無論是在陽性對(duì)照還是含藥培養(yǎng)基上在四周的報(bào)告期限內(nèi)菌落生長(zhǎng)不明顯,延遲1～2周可獲明顯結(jié)果。此類菌株生長(zhǎng)速度更為緩慢,但延長(zhǎng)時(shí)間觀察是否會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性卻值得探討。(2)絕大多數(shù)耐藥菌株耐藥百分比均較大,但偶有臨床提示療效欠佳(治療3個(gè)月末仍菌陽)而藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示利福平0＜耐藥百分比≤1%的病例,重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然相同。此類標(biāo)本用絕對(duì)濃度法檢測(cè)是否為RFP低濃度耐藥,高濃度敏感尚不得而知。但有文獻(xiàn)報(bào)道,比例法和絕對(duì)濃度法在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)1NH、RFP和 EMB的藥物敏感性時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3]。

3.5 2009年陽性對(duì)照生長(zhǎng)良好的20株標(biāo)本SM、EMB全部耐藥,與國(guó)家參比室的結(jié)果相比符合株數(shù)比卻分別只有4/22,5/22。因同批H37Rv敏感株受溫度影響較大,其結(jié)果不能作為評(píng)價(jià)含藥培養(yǎng)基質(zhì)量的依據(jù),結(jié)合同時(shí)參加這兩次試驗(yàn)的其他實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果,推測(cè)可能為含藥培養(yǎng)基的配制問題。

3.6 SM、EMB與國(guó)家參比室的結(jié)果相比仍未達(dá)到符合率90%的要求,其原因仍有待分析。

4 對(duì)策

根據(jù)參加結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)結(jié)合本室平時(shí)結(jié)核桿菌培養(yǎng)和藥物敏感性試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn),筆者認(rèn)為提高結(jié)核桿菌藥物敏感性試驗(yàn)準(zhǔn)確率要注重做好下列工作。

4.1 培養(yǎng)基的配制及保存 培養(yǎng)基的配制主要注意各藥物的質(zhì)量、稱量的準(zhǔn)確性、稀釋比例的正確與否及滅菌的溫度和時(shí)間等;培養(yǎng)基應(yīng)在2～8℃低溫保存且不超過3個(gè)月,不得暴露在紫外線下。

4.2 實(shí)驗(yàn)過程的規(guī)范化 (1)做好實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及實(shí)驗(yàn)器材的消毒滅菌工作。(2)防范交叉污染。批量測(cè)試時(shí)在磨菌、稀釋及接種過程中均有產(chǎn)生交叉污染的可能。特別是要防范粘有菌液的塑料接種環(huán)彈出試管外引起交叉污染和環(huán)境污染。(3)1mg/m l菌液的配制：首先挑取盡可能大范圍的菌落,以防漏掉可能的變異株;其次挑取菌落時(shí)不得雜有培養(yǎng)基,菌落要盡可能磨勻,并取適量生理鹽水沖洗磨菌棒及管壁后混勻放置,待未磨勻的粗大顆粒沉淀后取液體上部混懸液稀釋比濁,稀釋管與標(biāo)準(zhǔn)比濁管材質(zhì)及大小要盡可能一致,便于肉眼比濁。(4)接種菌液前先觀察培養(yǎng)基是否新鮮,有無污染,稀釋與接種時(shí)均要注意稀釋是否均勻,挑取菌液是否足量,有沒有挑空環(huán)或氣泡。用劃線法接種注意盡可能使菌液均勻分散于培養(yǎng)基斜面。

4.3 每天作好培養(yǎng)環(huán)境溫度的監(jiān)測(cè) 將培養(yǎng)箱的溫度控制在(36.5±1)℃。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的最適生長(zhǎng)溫度為35～37℃,而有些類型的分枝桿菌在25℃、30～33℃或45℃也可生長(zhǎng)[4]。

4.4 結(jié)果觀察時(shí)兩濃度陽性對(duì)照管應(yīng)顯示明顯的濃度梯度,以此作為判斷菌液稀釋比例正確與否在觀察結(jié)果時(shí),無論是在這兩批次的測(cè)試中,還是在日常的藥敏檢測(cè)中也常見菌株生長(zhǎng)速度不一的現(xiàn)象。有的菌株生長(zhǎng)快速,在1周內(nèi)生長(zhǎng)的多為非典型分枝桿菌,在PNB培養(yǎng)基中可生長(zhǎng),據(jù)此可與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群相鑒別[5],2008-2010年本室檢測(cè)出非典型分枝桿菌7例,其中痰標(biāo)本5例,尿標(biāo)本2例,菌落初次生長(zhǎng)時(shí)間均小于7d。

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The Proportion of Indirect Detection of Mycobacterium Tuberculosis Drug Susceptibility Testing of Factors

CAO Hongyuan,WANGHuaitang.TBControlCenterofXianningCity,HubeiProvince437100

Objective：To explore the influence of indirect proportion method in testing Mycobacterium tuberculosis.Methods：Mycobacterium tubercu losis d rug suscep tibility testing resultsw ere com pared and analyzed to identify the key fac tors of success or failure of experiments,including preparation of the quality of the drug-containing medium control, experimental process of standardization,real-timemonitoring of the ambient temperature,the results of observations and judgments,etc.Results：2010 national TB reference room with suscep tibility results consistent with a greater rate than the increase in 2009.Conclusion：The quality of themedium,culture temperature and skilled operators will affect the degree of suscep tibility test resu lts.

Indirect proportion method,Mycobacterium tuberculosis,Drug sensitivity test,Factors

R446.5

A

1001-7585(2011)10-1121-03

國(guó)家第五輪全球基金耐多藥結(jié)核病防治項(xiàng)目

2011-03-23

(編輯江山)

病例報(bào)告