王江峰， 魯 瑩， 鐘延強

(第二軍醫(yī)大學藥劑學教研室，上海 200433)

聚氨基酯作為基因載體的研究進展

王江峰， 魯 瑩， 鐘延強

(第二軍醫(yī)大學藥劑學教研室，上海 200433)

隨著基因治療研究的不斷深入，尋求一種高效、安全、靶向表達的載體已成為了基因治療的核心問題之一。聚氨基酯(poly amino ester,PAE)作為一種新型的陽離子聚合物基因載體，具有原料廉價、合成簡單、結(jié)構(gòu)多樣、可降解、細胞毒性低和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，已越來越受到人們的關(guān)注。本文將從聚氨基酯的合成途徑、理化性質(zhì)、聚氨基酯/DNA納米粒的制備及聚氨基酯/DNA納米粒轉(zhuǎn)染效率和影響因素等方面詳細闡述了近年來聚氨基酯作為基因載體的研究進展。

聚氨基酯；非病毒基因載體；陽離子聚合物

成功的基因治療在很大程度上取決于是否有合適的載運系統(tǒng)。目前進行研究的基因載體主要有兩類：病毒載體和非病毒載體。雖然病毒型基因載體由于轉(zhuǎn)染效率高而被較多的應用，但病毒載體也存在著自身難以克服的局限性，諸如誘導宿主免疫反應，潛在的致癌性，制備復雜生產(chǎn)不能規(guī)?；?，靶向性差，所能裝載的外源DNA 大小有限等，使其應用受到很大限制[1,2]。因此低毒、低免疫反應、易組裝、經(jīng)濟、便于大規(guī)模普及應用和可反復應用的非病毒型基因載體越來越成為當今研究的焦點。

陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物是目前廣泛研究的兩類非病毒型基因載體。脂質(zhì)體作為常用的非病毒性載體容易制備，安全性高。但由于很難達到質(zhì)控要求，且體內(nèi)基因?qū)胄实停鋺檬艿较拗?。在陽離子聚合物型載體中的合成高分子材料，包括聚乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺-胺(PAMAM)、聚-L-賴氨酸(pLL)，雖然轉(zhuǎn)染效率較高[3～5]，但也存在著不能降解、容易在體內(nèi)累積、細胞毒性大等缺點；而殼聚糖等天然高聚物雖然有很好的生物相容性，卻存在著轉(zhuǎn)染效率低的問題。因此尋求和發(fā)展一種同時具備高效低毒特性的陽離子聚合物作為基因載體，是現(xiàn)在和今后研究基因載體的一個突破點。聚氨基酯的合成以及在基因傳遞系統(tǒng)中的成功應用，正逐漸吸引中外研究者的目光。

1 聚氨基酯的合成及理化性質(zhì)

1.1線性聚氨基酯的合成及其理化性質(zhì) 1970年Ferruti等[6]首次報道了以二胺(bifunctional amines)和二丙烯酸酯(diacrylate esters)為原料，通過邁克爾加成反應合成了骨架中含有叔胺的線性聚氨基酯。2000年，David 等[7]首先以N,N-二甲基乙二胺、哌嗪、4,4-丙基哌啶基哌啶作為二胺，分別與1,4-丁二醇二丙烯酸酯反應生成相應的聚氨基酯并成功應用于基因的傳遞。聚氨基酯都能很好的溶于四氫呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇等有機溶劑中，同時還能夠溶于酸性水溶液中。而通過研究發(fā)現(xiàn)，由于逆邁克爾加成反應的存在，聚氨基酯在生理條件下能夠發(fā)生不同速度的降解。當聚氨基酯處于pH=5的環(huán)境下，降解明顯減緩，當聚氨基酯處于強酸(pH<3)或強堿(pH>12)環(huán)境下幾乎不發(fā)生降解。David 等[8]還以7種二丙烯酸酯和20種二胺作為原料，制備了140種線性聚氨基酯，然后進行篩選。而Akin等[9]則對反應條件進行了優(yōu)化，他們以1,4-丁二醇二丙烯酸酯(或1,6-己二醇二丙烯酸酯)和4-氨基-1-丁醇為原料，在不使用反應溶劑的條件下，將反應溫度提升至100 ℃ ，這樣持續(xù)反應僅僅5 h就能制得相應的聚氨基酯，大大節(jié)省了反應時間。實驗中發(fā)現(xiàn)4-氨基-1-丁醇與1,4-丁二醇二丙烯酸酯(或1,6-己二醇二丙烯酸酯)根據(jù)不同摩爾比反應生成的聚氨基酯在理化性質(zhì)上有著明顯的變化。當兩種反應物的摩爾比越接近1時，所生成聚氨基酯的分子量越大，與此相反，無論是二胺過量還是二丙烯酸酯過量，聚氨基酯的聚合程度都會降低。在用傳統(tǒng)的合成工藝來制備和篩選聚氨基酯的過程中，科研人員總是習慣性的在一次實驗中合成一種聚氨基酯并對其性質(zhì)進行試驗。這樣的方式在生物醫(yī)學高分子材料的合成篩選中應用相當普遍，但是卻相當費時。因此Daniel等[10]采用了半自動化的高通量合成法來合成聚氨基酯，并一次性對2 350種聚氨基酯進行了篩選。

1.2支鏈聚氨基酯的合成和理化性質(zhì) 由于線性聚氨基酯的結(jié)構(gòu)中只有叔胺的存在，因此大多數(shù)的線性聚氨基酯對DNA的包裹能力并不理想。而支鏈聚氨基酯作為基因載體相對于線性聚氨基酯來說存在著眾多的優(yōu)勢：首先支鏈聚氨基酯的水溶性要比線性聚氨基酯效果要好；其次支鏈聚氨基酯中存在著伯胺，能更好的包裹DNA，而且粒徑也明顯小于線性聚氨基酯包裹DNA所形成的納米顆粒；此外高密度的叔胺和仲胺使得支鏈聚氨基酯有了更大范圍的pH緩沖能力；最后由于伯胺和仲胺的存在，使得可以更方便地進行結(jié)構(gòu)修飾。制備支鏈聚氨基酯的方法一般有兩種：①二丙聚氨基酯烯酸酯與多胺反應；②二胺與多丙烯酸酯反應。Zhong等[11]采用二丙烯酸酯與多胺反應的方法，以N-甲基乙烯基二胺、1 -(2 -氨乙基)哌嗪、4-(氨甲基)哌啶與乙二醇二丙烯酸酯、1,4-丁二醇二丙烯酸酯、1,6-己二醇二丙烯酸酯為原料反應生成多種支鏈聚氨基酯。而Tae-il等[12]則是以N,N-二甲基已二胺和季戊四醇三丙烯酸酯為原料，采用二胺與多丙烯酸酯反應的方法制備支鏈聚氨基酯。除此以外也有少數(shù)研究人員不采用邁克爾加成反應的方法來制備支鏈聚氨基酯，比如Hyun等[13]就是應用特殊的化合物以酯化反應合成相應的聚氨基酯。

在一定范圍內(nèi)，反應時間的長短與支鏈聚氨基酯分子量的大小存在著一定關(guān)系，反應時間越長，分子量就越大。支鏈聚氨基酯在水中的降解速度同樣跟pH值有關(guān)，生理條件下的降解速度要快于酸性條件下的降解速度，和親水性有關(guān)。此外，支鏈聚氨基酯的降解速度還跟親水性有關(guān)，親水性高的支鏈聚氨基酯降解速度更快。此外，支鏈聚氨基酯在pH5.1～7.4直接具有更強的酸堿緩沖能力。

2 聚氨基酯納米粒的制備及納米粒的基本特征

為了保護DNA避免酶解并增加有效吸收，將DNA復合成粒子是有效傳遞和轉(zhuǎn)染基因至關(guān)重要的一環(huán)，因此陽離子聚合物作為非病毒基因載體的第一步是將其有效包裹形成一種穩(wěn)定均一的載基因納米粒[14,15]。目前聚氨基酯納米粒的制備方法主要有復凝聚法和自組裝法。而聚氨基酯載基因納米粒主要采用的是后者，即通過聚氨基酯表面的陽電荷與基因所帶的負電荷相互吸引，自發(fā)形成納米粒。

大多數(shù)聚氨基酯載基因納米粒的粒徑在150 nm以下，粒子表面帶正電荷。影響聚氨基酯載基因納米粒生物物理學特征的因素包括N/P比、聚氨基酯分子量、聚氨基酯化學結(jié)構(gòu)和pH值等[16]。在一定范圍內(nèi)，隨著N/P比的增大納米粒粒徑會逐漸減小，而ζ電位則逐漸增大。聚氨基酯分子量的大小影響聚氨基酯對DNA的親合力，當聚氨基酯分子量小于11 kDa時，即使質(zhì)量比達到150:1，都不能很有效的濃縮和包裹DNA，當聚合物分子量大于13 kDa時，質(zhì)量比在10:1左右，就能很好的包裹DNA。在相同N/P比時，聚氨基酯分子量愈大，相同條件下制得納米粒粒徑愈小，ζ電位相對愈大，這也說明大分子量的聚氨基酯能夠更有效的包裹DNA。而聚氨基酯的化學結(jié)構(gòu)則是影響聚氨基酯有效包裹DNA最主要的原因，在Daniel等[10]所篩選的2 350種聚氨基酯中，絕大部分的聚氨基酯并不能完全包裹住DNA，有的聚氨基酯納米粒的粒徑達到數(shù)千納米，有的聚氨基酯納米粒的ζ電位則為負值。此外，當聚氨基酯的單體為氨基醇和疏水性丙烯酸酯時，納米粒的粒徑則是最小的，同時轉(zhuǎn)染效率也是最高的。聚氨基酯納米粒一般是在酸性緩沖溶液中制備，如果將納米粒轉(zhuǎn)移至pH 7.4的環(huán)境下，納米粒粒徑會明顯增大。

在進行體外細胞轉(zhuǎn)染實驗中，非病毒載體的轉(zhuǎn)染通常是在無血清培養(yǎng)基中進行，因為在血清存在情況下，非病毒載體制劑的轉(zhuǎn)染效率會很低[17]。Jordan等[18]將粒徑小于150 nm聚氨基酯納米粒置于含血清的溶液后發(fā)現(xiàn)，所有納米粒的粒徑發(fā)生了顯著的變化。其中少數(shù)粒子粒徑突增到200 nm后保持相對穩(wěn)定；而多數(shù)粒子發(fā)生了聚集，粒徑達到微米級，甚至有一些粒子的表面電荷由原來的正電荷變成了負電荷，造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于帶負電荷的血清蛋白吸附到帶正電荷的納米粒粒子表面，致使整個納米粒表面呈荷負電荷特征。有趣的是，納米粒粒徑和ζ電位在血清中的改變和聚氨基酯單體化合物的單個原子改變有關(guān)。這更進一步證明了聚氨基酯的化學結(jié)構(gòu)是聚氨基酯載基因納米粒生物物理學特征的主要影響因素。

3 聚氨基酯/DNA納米粒轉(zhuǎn)染效率及影響因素

3.1轉(zhuǎn)染機制 陽離子聚合物與DNA通過電荷作用形成穩(wěn)定的陽離子聚合物/DNA復合物，經(jīng)過運輸，納米粒達到靶細胞后，納米粒子與靶細胞表面的陰離子蛋白聚糖等相互作用，通過內(nèi)吞入胞等方式被轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，陽離子物質(zhì)在酸性的吞噬囊泡內(nèi)聚集，增加內(nèi)吞泡的pH值，從而抑制DNA被溶酶體酶降解，同時還可引起質(zhì)子的內(nèi)流，使內(nèi)吞泡囊失去穩(wěn)定，DNA釋放到細胞質(zhì)中，DNA隨之通過核孔或在核定位信號介導下進入細胞核，并離開陽離子載體解縮合而復原成生物活性的DNA，進而發(fā)揮效應[19]。PEI具有很高的細胞轉(zhuǎn)染效率是因為它能通過質(zhì)子海綿機制(“proton sponge” mechanism)直接實現(xiàn)基因的核內(nèi)體逃逸。而Akin等[20]通過標有pH敏感熒光和非pH敏感熒光的雙標DNA表明聚氨基酯對基因的轉(zhuǎn)染同樣跟質(zhì)子海綿機制有關(guān)。

3.2聚氨基酯與DNA之間的親和力對轉(zhuǎn)染效率的影響 Daniel等[10]采用半自動化的高通量合成法合成聚氨基酯，并對合成的2 350種聚氨基酯進行篩選后發(fā)現(xiàn)，其中有46種聚氨基酯的轉(zhuǎn)染效率要高于PEI，而絕大多數(shù)的聚氨基酯的轉(zhuǎn)染效率并不十分理想，顯然這與不同聚氨基酯之間不同化學結(jié)構(gòu)有著密切的聯(lián)系。聚氨基酯化學結(jié)構(gòu)的差異，表現(xiàn)為聚氨基酯和DNA之間親合力的不同。聚合物和DNA之間的親合力有助于粒子的穩(wěn)定性，從而能夠保證DNA始終受到保護而不被酶解，同時也能夠提高細胞攝取率。但是考慮到聚合物跟DNA之間的親合力太強，納米粒包裹太緊密，DNA有可能不易從納米粒中釋放出來，而降低轉(zhuǎn)染效率。有報道指出，當多聚賴氨酸分子鏈超過一定長度之后，多聚賴氨酸載基因復合物會明顯阻礙RNA的合成，從而降低了轉(zhuǎn)染效率[21]。同樣，PEI在分子量為25 kDa時具有最佳轉(zhuǎn)染效率，分子量的進一步增大并不能提高它的轉(zhuǎn)染效率[22]。但是筆者也發(fā)現(xiàn)當聚氨基酯的分子量小于8 kDa的情況下，其轉(zhuǎn)染效率相對較低。因此聚合物/DNA之間的親合力跟轉(zhuǎn)染效率之間存在著一種微妙的關(guān)系，親合力太大或者太小都不能使基因轉(zhuǎn)染達到最佳狀態(tài)。

3.3聚氨基酯末端基團對轉(zhuǎn)染效率的影響 聚氨基酯末端基團的改變對轉(zhuǎn)染效率也有著很大的影響。如果在聚氨基酯合成過程中丙烯酸酯過量(以酯基封端)，那么其轉(zhuǎn)染效率要遠遠低于以胺基封端的聚氨基酯。以含有羥基或者額外胺的親水性胺基封端的聚氨基酯具有最佳的轉(zhuǎn)染效率；相反，如果封端基團是含有烷基或者芳香基團的疏水性胺基，那么該聚氨基酯具有很低的轉(zhuǎn)染效率[23]。

3.4聚氨基酯載基因納米粒的非特異靶向性 載基因納米粒形成后，細胞對納米粒的有效攝取是決定轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵。細胞攝取可分為靶向性和非特異靶向性。對于非特異靶向性細胞攝取，最重要的是納米粒粒子表面呈正電荷，這樣納米粒就可通過靜電吸附跟帶負電荷的細胞表面蛋白結(jié)合，從而被轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。納米粒粒徑的大小也是影響細胞攝取的重要因素之一，粒徑越小越易于細胞攝取，當粒徑在100 nm左右時，細胞攝取達到最佳狀態(tài)。事實上，粒徑大小對轉(zhuǎn)染效率的影響一直存在著爭議。因此，轉(zhuǎn)染效率的大小應該把粒子粒徑、電勢電位和聚合物分子量等諸多因素一起加以考慮。比如對于體外細胞實驗來講，大粒徑的納米粒可以更好的沉積并提高轉(zhuǎn)染效率；但對于體內(nèi)實驗來說，大粒徑的納米粒很容易被巨噬細胞吞噬，不能有效的運輸至有效位點[18]。

3.5聚氨基酯載基因納米粒的特異靶向性 Langer實驗室采用了兩種方法來實現(xiàn)聚氨基酯載基因納米粒制劑的靶向性。第一種方法是Gregory等[24]以2-(硫代吡啶)乙胺為胺單體合成聚氨基酯，這樣聚氨基酯側(cè)鏈中的硫代吡啶就可以與巰基化的RGD蛋白等配體結(jié)合，使其具有靶向性。但是這樣的方法存在著一定的缺陷，靶向配體的共價鍵連接改變了納米制劑的生物物理學特征。在實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著配體取代率的提高，聚氨基酯對基因的轉(zhuǎn)染效率會有略微的下降，導致這種現(xiàn)象的原因可能是配體的連接使得聚氨基酯原有的化學結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而改變了聚氨基酯的核內(nèi)體緩沖能力和對DNA的濃縮能力。為了使聚氨基酯納米粒在具有靶向性的同時，又不改變聚合物原來的化學功能學結(jié)構(gòu)，Jordan等[25]采用靜電吸附的方法，使帶負電荷的蛋白配體自發(fā)的吸附包裹在帶正電荷的納米粒子表面，形成粒徑在100～200 nm之間的穩(wěn)定的具有靶向性的載基因納米粒。通過透射電鏡觀察，該納米粒在血清存在的環(huán)境下仍非常穩(wěn)定，這說明以該方式形成的靶向納米粒由于其表面電荷由原來的正電荷調(diào)節(jié)為近中性，從而能夠降低非特異性基因傳遞并減少納米粒與潛在的血清蛋白的相互作用。實驗結(jié)果也顯示該載基因納米的轉(zhuǎn)染效率要遠遠高于相對應的非靶向性聚氨基酯載基因納米粒。

4 結(jié)束語

聚氨基酯作為一種新型的陽離子聚合物基因載體，具有多方面的優(yōu)點：①聚氨基酯含有在酸性和生理條件下帶陽離子的氨基，能與帶負電荷的DNA縮合成穩(wěn)定的納米粒；②聚氨基酯含有能夠降解的酯鍵，跟其它陽離子聚合物相比細胞毒性??；③聚氨基酯化學結(jié)構(gòu)多樣性，合成聚氨基酯的原料可以直接購買得到，合成工藝簡單方便；④無論是體內(nèi)還是體外，轉(zhuǎn)染效率高。同時，也可以通過聚氨基酯末端基團的修飾以及聚氨基酯載基因納米粒靶向配體的修飾來進一步提高轉(zhuǎn)染效率。此外，半自動化高通量合成法篩選聚氨基酯的方法，也能借鑒運用于其他高分子材料或藥物篩選實驗中去。

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2010-08-02

[修回日期] 2010-10-12

Researchonpolyaminoesterasthegenevector

WANG Jiang-feng, LU Ying，ZHONG Yan-qiang

(Department of pharmaceutical, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

With the deepening research of gene therapy, to find an efficient, safe, targeted expression gene vector had become one of the core issues of gene therapy. Poly amino ester (PAE) as a new type of cationic polymer gene carriers, with cheap raw materials, simple synthesis, diversity structure, biodegradability, low toxicity and high efficiency transfection, which had attracted lots of researchers' focus. Recent research of PAE as a gene vector from the poly amino ester synthesis pathway, physical and chemical properties, properties of poly amino ester / DNA nano-particles and transfection efficiency of polyamino ester/DNA nano-particles were summarized in this paper.

poly amino esters; non-viral gene vector; cationic polymer

王江峰(1984-)，男，碩士研究生.E-mail:air008@163.com.

鐘延強. Tel：(021)81871285, E-mail:yqzhong@smmu.edu.cn.

R943

A

1006-0111(2011)03-0165-04