馬碧書，蘇紹祥，楊照青

（1.昆明醫(yī)學(xué)院海源學(xué)院微生物學(xué)暨免疫學(xué)教研室，云南昆明650106；2.昆明醫(yī)學(xué)院海源學(xué)院病原實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650106；3.昆明醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，云南昆明650031）

肉孢子蟲免疫學(xué)及相關(guān)研究進(jìn)展

馬碧書1，3，蘇紹祥2，楊照青3*

（1.昆明醫(yī)學(xué)院海源學(xué)院微生物學(xué)暨免疫學(xué)教研室，云南昆明650106；2.昆明醫(yī)學(xué)院海源學(xué)院病原實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650106；3.昆明醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，云南昆明650031）

肉孢子蟲作為一種抗原性物質(zhì)進(jìn)入宿主體內(nèi)，能刺激機(jī)體發(fā)生特異性免疫應(yīng)答。研究肉孢子蟲抗原結(jié)構(gòu)及其與宿主相互關(guān)系可為肉孢子蟲病的診斷、預(yù)防和治療提供可靠依據(jù)。本文綜述了近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)肉孢子蟲免疫學(xué)及相關(guān)課題的研究進(jìn)展。

肉孢子蟲，免疫學(xué)，

肉孢子蟲（Sarcocystis）屬于頂復(fù)門（Apicomplex），孢子蟲綱（Sporozoa），真球蟲目（Eucoccidia），肉孢子蟲科（Sarcocystidae），種類較多，廣泛寄生于兩棲類、爬行類、鳥類、哺乳類等，引起人畜共患肉孢子蟲?。╯arcocystosis）。該病流行廣泛，感染率高，對(duì)人畜危害較大。

開展肉孢子蟲免疫學(xué)研究，探討其與宿主之間的相互關(guān)系不僅為疾病的診斷、療效判定等提供檢測(cè)手段，同時(shí)還為疫苗研制提供可靠依據(jù)。近年來，肉孢子蟲的免疫學(xué)研究取得了很大進(jìn)展，本文就此作一綜述。

1 血清抗體檢測(cè)

1.1 用于流行病學(xué)調(diào)查

應(yīng)用特異性血清抗體檢測(cè)的方法可以大量地、廣泛地進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，從而了解肉孢子蟲病的流行情況，更好地控制疾病的傳播。Mitchell等［1］以福爾馬林固定的裂殖子作為抗原檢測(cè)康涅狄格州臭鼬、浣熊、負(fù)鼠的神經(jīng)肉孢子蟲（Sarcocystis neurona）凝集素抗體，感染率分別為臭鼬46%（11／24），浣熊100%（10／10），負(fù)鼠0（0／7）；Lindsay DS等用同樣的方法檢測(cè)99只浣熊的神經(jīng)肉孢子蟲凝集素抗體，44%（44／99）的浣熊神經(jīng)肉孢子蟲抗體陽性，效價(jià)大于或等于1：500，這個(gè)結(jié)果和用western blot法測(cè)定的美國(guó)馬的神經(jīng)肉孢子蟲抗體陽性率33%～60%的報(bào)道相似。

Vardelieon D等用免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)美國(guó)5個(gè)不同地方（根據(jù)弗吉尼亞負(fù)鼠屬分布抽樣）馬的神經(jīng)肉孢子蟲抗體，共檢查了208份血清樣本，神經(jīng)肉孢子蟲抗體陽性率從0（新澤西和蒙大拿）到54%（密蘇里）不等；Tanhauser SM等應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)野外捕捉的19只和馴養(yǎng)的17只九帶犰狳，前者神經(jīng)肉孢子蟲抗體均為陽性，后者只有1只陽性，說明九帶犰狳對(duì)神經(jīng)肉孢子蟲的自然感染率高。Valadas S等人［2］使用血清學(xué)診斷方法，對(duì)除神經(jīng)肉孢子蟲外的多個(gè)蟲種進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查。

1.2 發(fā)現(xiàn)肉孢子蟲新宿主

對(duì)肉孢子蟲病流行區(qū)不同動(dòng)物體內(nèi)相應(yīng)抗體進(jìn)行檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)肉孢子蟲新宿主，有利于研究肉孢子蟲對(duì)不同動(dòng)物的感染情況，從而更好地控制感染。

Gillis KD等［3］用血清學(xué)方法檢測(cè)了100只貓的神經(jīng)肉孢子蟲抗體并同時(shí)對(duì)其中的50只貓進(jìn)行肌肉切片法檢查，在5（10%）只貓的肌肉中找到肉孢子蟲包囊，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)確認(rèn)為貓肉孢子蟲（S.felis）；同時(shí)，抗神經(jīng)肉孢子蟲抗體陽性率為5%（5／100），但在肌肉中未找到神經(jīng)肉孢子蟲。據(jù)此，他認(rèn)為貓有感染神經(jīng)肉孢子蟲的可能。此后，一些學(xué)者對(duì)貓?bào)w內(nèi)神經(jīng)肉孢子蟲感染情況進(jìn)行了相關(guān)研究，并報(bào)道了貓感染神經(jīng)肉孢子蟲相關(guān)性腦炎的病例。因此，貓被認(rèn)為是神經(jīng)肉孢子蟲生活史中的自然中間宿主。

最新的報(bào)道來自Hsu V等［4］對(duì)弗吉尼亞和賓夕法尼亞州貓?bào)w內(nèi)的神經(jīng)肉孢子蟲抗體的檢測(cè)。他們?nèi)?41只貓（弗吉尼亞232只，賓夕法尼亞209只）血清，作1：50稀釋，采用間接熒光抗體試驗(yàn)（indirect fluorescent antibody test，IFAT）檢測(cè)神經(jīng)肉孢子蟲裂殖子抗體。結(jié)果32只貓（7%，32／441）檢測(cè)到特異性IgG抗體，其中22只來自弗吉尼亞，陽性率9%（22／232）；10只來自賓夕法尼亞，陽性率5%（10／209）。

1.3 輔助診斷肉孢子蟲病

肉孢子蟲寄生于中間宿主的肌肉組織中，病原學(xué)診斷取材不易，且耗時(shí)耗力；在終宿主體內(nèi)，卵囊或孢子囊雖可隨糞便排出體外，但因其體積微小，無色透明，容易漏診。免疫學(xué)診斷技術(shù)可作為輔助手段彌補(bǔ)這方面的不足。

早在上世紀(jì)70年代，人們就開始了肉孢子蟲血清學(xué)診斷的研究［5～6］，得出以下重要結(jié)論：①口服肉孢子蟲抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，但是冰凍或加熱肉孢子蟲抗原會(huì)降低其免疫原性；②肉孢子蟲抗體能通過免疫學(xué)方法檢測(cè)到，較為可靠的方法是IFAT；③肉孢子蟲抗體在中間宿主和終宿主體內(nèi)均能檢測(cè)到；④肉孢子蟲抗原與弓形蟲病患者血清無交叉反應(yīng)，這一點(diǎn)已在弓形蟲病患者及弓形蟲實(shí)驗(yàn)感染小鼠血清中得到證實(shí)。

肉孢子蟲血清抗體檢測(cè)常用于肉孢子蟲病的輔助診斷，據(jù)此發(fā)現(xiàn)了不少肉孢子蟲感染病例。如在341例弓形蟲疑似病例中檢測(cè)到22.5%～44.4%的病人血清肉孢子蟲抗體陽性，但此種病例至今報(bào)告較少，分布不均。一支由15人組成的美國(guó)軍隊(duì)在馬來西亞農(nóng)村執(zhí)行任務(wù)時(shí)，有7人出現(xiàn)發(fā)熱、肌痛、支氣管痙攣、嗜酸性皮下結(jié)節(jié)等急性癥狀，對(duì)其中的8人進(jìn)行肉孢子蟲抗體檢測(cè)，6人陽性，且4例有嗜酸性肌炎者均為陽性。據(jù)此，Arness MK等認(rèn)為這次嗜酸性肌炎的暴發(fā)是由肉孢子蟲感染引起的。

為了檢測(cè)馬神經(jīng)肉孢子蟲感染后血清抗體含量及特異性抗體效價(jià)的變化，Heskett KA等［7］用18匹成年馬進(jìn)行了研究。14匹馬作為試驗(yàn)組，感染神經(jīng)肉孢子蟲孢子囊（因有其他的研究目的，一些實(shí)驗(yàn)組馬匹斷斷續(xù)續(xù)接受了ponazuril治療，劑量20 mg／kg，PO）；4匹作對(duì)照。在感染第1天和第84天收集腦脊液和血液標(biāo)本，以裂殖子可溶性抗原作為診斷試劑，采用ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）直接法檢測(cè)神經(jīng)肉孢子蟲特異性IgG，分別報(bào)告SN（CSF）和SN（plasma）。用夾心ELISA和IFA法（immunofluorescence assay）分別檢測(cè)腦脊液中的IgG總量（IgG，CSF）和血清中的IgG總量（IgG，plasma），計(jì)算Q（SN），Q（IgG）和AI（antibody index）。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組SN（CSF）和SN（plasma）顯著升高，而總抗體含量無明顯變化。這提示我們特異性抗體含量可以用于馬的神經(jīng)肉孢子蟲相關(guān)腦脊髓炎的輔助診斷。Witonsky［8］的研究也得出了相似的結(jié)果。

1.4 用于家畜屠宰前的檢疫

本世紀(jì)初，我國(guó)學(xué)者周望平［9］等已報(bào)道用快速ELISA法診斷家畜住肉孢子蟲病，并將該法推廣應(yīng)用于家畜屠宰前的檢疫。他們采用梭形住肉孢子蟲（S.fusiformis）、枯氏住肉孢子蟲（S.cruzi）制備可溶性抗原，研制出住肉孢子蟲病快速ELISA診斷試劑盒，用作豬、牛、羊住肉孢子蟲病的快速診斷。并用該試劑盒檢測(cè)了湖南省洞庭湖地區(qū)具有代表性的華容縣、沅江市屠宰水牛、豬的住肉孢子蟲感染情況，證明該試劑盒具有快速、準(zhǔn)確、敏感性高等特點(diǎn)。該法操作過程不需任何特殊儀器，30 min即可獲得結(jié)果，具有很強(qiáng)的敏感性和實(shí)用性。研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用此EIISA診斷試劑盒的顯色反應(yīng)與動(dòng)物住肉孢子蟲感染強(qiáng)度呈正相關(guān)，即動(dòng)物感染強(qiáng)度越高，顯色越深，反之，顯色越淡，據(jù)此可判斷家畜感染程度。Moré［10］等人也將此法應(yīng)用于農(nóng)場(chǎng)牛感染肉孢子蟲的檢查。

2 免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)肉孢子蟲感染進(jìn)行定位

隨著抗原的提純以及抗體標(biāo)記技術(shù)的改進(jìn)，尤其是單克隆抗體技術(shù)和原位雜交技術(shù)的引入，免疫細(xì)胞化學(xué)在生物基礎(chǔ)研究中日益顯示出巨大的實(shí)用價(jià)值。免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry）就是一個(gè)很好的例子，把免疫反應(yīng)的特異性和組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡的顯像和放大作用進(jìn)行檢測(cè)。用標(biāo)記的肉孢子蟲特異性抗體可以對(duì)組織內(nèi)肉孢子蟲的分布進(jìn)行細(xì)胞和組織定位。

Dubey JP［11］等在野外捕捉的負(fù)鼠腸道中找到肉孢子蟲孢子囊（感染率為54.5%，24／44），孢子囊數(shù)低的少于1萬，高的超過2億，并將24只陽性負(fù)鼠來源的孢子囊喂給γ－干擾素基因敲除小鼠或裸鼠，其中14只負(fù)鼠來源的孢子囊對(duì)小鼠具有感染性。通過神經(jīng)肉孢子蟲抗體特異性染色，在小鼠組織找到了神經(jīng)肉孢子蟲。應(yīng)用同樣的方法，在密西西比河流域的農(nóng)村，從19只負(fù)鼠腸道取來的孢子囊感染的小鼠腦部發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)肉孢子蟲。Burcham等［12］通過免疫組化方法對(duì)有神經(jīng)癥狀的臭鼬（striped skunk，Mephitismephitis）進(jìn)行研究表明，免疫抑制是所研究的臭鼬患神經(jīng)肉孢子蟲感染的重要因素。Wünschmann等［13］通過免疫組化方法和基因研究手段對(duì)S.falcatula自然感染鷹的研究進(jìn)行了報(bào)道。Britton等［14］對(duì)雪貂（ferret，Mustela putorius furo）感染肉孢子蟲的研究也使用了類似的方法。

3 分析研究肉孢子蟲抗原，促進(jìn)血清學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展

對(duì)肉孢子蟲抗原成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，探討這些抗原與肉孢子蟲的相互關(guān)系是免疫學(xué)研究的關(guān)鍵。神經(jīng)肉孢子蟲在美國(guó)作為馬原蟲性腦脊髓炎（equine protozoalmyeloencephalitis，EPM）的主要病原體而被廣泛熟知，其裂殖子表面抗原（surface antigens of S.neurona，SnSAGs）是疾病的主要原因。這些表面抗原為免疫顯性抗原，因此是EPM診斷和疫苗研制的重要備選成分。

3.1 肉孢子蟲病血清學(xué)診斷技術(shù)面臨挑戰(zhàn)

長(zhǎng)期以來，人們主要通過對(duì)馬血清或腦脊液中SAG－1抗體進(jìn)行檢測(cè)來診斷EPM。近日，Johnson AL等［15］用ELISA法、IFAT兩種方法對(duì)EPM自然感染病例進(jìn)行臨死前診斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ELISA法檢測(cè)血清標(biāo)本SAG－1敏感性為12.5%（95%CI，1.6～38.4），特異性為97.1%（95%CI，84.7～99.9）；IFAT法檢測(cè)，血清標(biāo)本敏感性為94.4%（95%CI，72.7～99.9），特異性為85.2%（95%CI，66.3～95.8）；腦脊液標(biāo)本敏感性為92.3%（95%CI，64.0～99.8），特異性為89.7%（95%CI，72.7～97.8）。據(jù)此認(rèn)為SAG－1 ELISA檢測(cè)的低敏感性限制了它在診斷EPM的應(yīng)用，而IFAT檢測(cè)法也不是最佳的方法。研究肉孢子蟲相關(guān)抗原，尋找一種特異性更高，敏感性更強(qiáng)的抗原成為肉孢子蟲病血清學(xué)診斷的迫切需要。

3.2 神經(jīng)肉孢子蟲表面抗原多態(tài)性研究

已有研究證實(shí)，有些EPM感染的病原體主要表面抗原SnSAG1表達(dá)缺失［16—17］，這就提示我們不同的神經(jīng)肉孢子蟲表達(dá)的SnSAGs存在差異。因此，科學(xué)家們開展了大量的生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)的相關(guān)研究，試圖在眾多SnSAGs中找到特異性強(qiáng)，且具有保護(hù)作用的抗原成分。從EST（expressed sequence tag）庫(kù)獲悉，SnSAGs具有顯著的多態(tài)性，且EPM的病原SN4株缺乏主要的表面抗原SnSAG1，這一事實(shí)已經(jīng)通過Western blot和Southern blot證實(shí)。

為了研究神經(jīng)肉孢子蟲SnSAGs存在多態(tài)性，Howe DK等［16］采用Western blots法，用4種SnSAGs特異性抗體檢測(cè)了14株神經(jīng)肉孢子蟲。結(jié)果顯示，14株神經(jīng)肉孢子蟲均表達(dá)SnSAG2，SnSAG3和SnSAG4，但SnSAG4的表達(dá)在不同株之間存在差異；更為重要的是，7株神經(jīng)肉孢子蟲不表達(dá)SnSAG1，其中4例從EPM感染的馬分離出來，1例從患致死性腦膜腦炎的海獺體內(nèi)分離出來。采用PCR進(jìn)行遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SnSAG1表達(dá)缺失的7株神經(jīng)肉孢子蟲中有6株具有相同的基因序列?？傊煌蛛x株的神經(jīng)肉孢子蟲表面抗原的表達(dá)存在異質(zhì)性，這就提示我們，在研究EPM血清學(xué)診斷以及疫苗研制的過程中對(duì)于抗原分子的選取有待進(jìn)一步研究；同時(shí)，這種不均一性是否與肉孢子蟲的其他表型（如毒力等）以及肉孢子蟲有性生殖階段的發(fā)育等有關(guān)仍需進(jìn)一步探討。

3.3 發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肉孢子蟲新的表面抗原SnSAG5

神經(jīng)肉孢子蟲不同株之間SnSAGs存在多樣性，包括主要表面抗原SnSAG1的缺失。然而，Crowdus CA等［17］在2個(gè)SnSAG1缺失的蟲株發(fā)現(xiàn)了新的抗原，并對(duì)此抗原進(jìn)行了研究和報(bào)道，將其命名為SnSAG5。SnSAG5本質(zhì)上是一種與其他SAGs并存的表面分子，表達(dá)于神經(jīng)肉孢子蟲及其他相關(guān)的肉孢子蟲表面。Crowdus CA等收集了13株神經(jīng)肉孢子蟲，用Western blot方法進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)其中6株的SnSAG5取代了SnSAG1的表達(dá)，且SnSAG5不表達(dá)于SnSAG1陽性的蟲株。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了1株從海獺腦部分離出來的肉孢子蟲既不表達(dá)SnSAG1，也不表達(dá)SnSAG5。對(duì)SnSAG5特異性基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SnSAG5陽性蟲株表達(dá)相應(yīng)基因，并且該基因還表達(dá)于SnSAG1缺失、SnSAG5缺失的海獺分離株。這一發(fā)現(xiàn)推進(jìn)了神經(jīng)肉孢子蟲多樣性的研究，為EPM診斷方法的研究以及疫苗的研制提供了更充足的依據(jù)，同時(shí)，也促進(jìn)了對(duì)肉孢子蟲在終宿主負(fù)鼠體內(nèi)的生活史循環(huán)的群體生物學(xué)研究。

4 重組肉孢子蟲表面抗原應(yīng)用研究

近年來，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，許多生物技術(shù)引入到寄生蟲學(xué)的研究中。運(yùn)用分子克隆等技術(shù)可以獲得大量純化的重組寄生蟲抗原，使一些來源困難的抗原在分子水平上得到深入研究，為寄生蟲診斷抗原的制備以及疫苗的研制提供了新的途徑。先前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了編碼神經(jīng)肉孢子蟲表面抗原SnSAGs的基因群，這些表面抗原對(duì)宿主具有免疫原性，因此被認(rèn)為是診斷和疫苗研制的候選分子。

Hoane JS等［18］應(yīng)用ELISA法以rSnSAGs檢測(cè)馬血清中的相應(yīng)抗體。他們采集了36份馬血清，這些馬血清已經(jīng)當(dāng)前的金標(biāo)準(zhǔn)Western blot法證實(shí)檢測(cè)到神經(jīng)肉孢子蟲抗體。通過ELISA發(fā)現(xiàn)，rSnSAG2敏感性和特異性最高，分別為95.5%和92.9%，而rSnSAG1最低，分別為68.2%和71.4%。這也說明，rSnSAG1用于馬神經(jīng)肉孢子蟲感染的血清學(xué)診斷是不可靠的，應(yīng)該選擇其他敏感性和特異性更高的抗原取代rSnSAG1。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，這些抗原與馬的另外兩種寄生蟲——法氏肉孢子蟲（Sarcocystis fayeri）和赫氏新孢蟲（Neospora hughes）無交叉反應(yīng)。rSnSAG ELISAs與神經(jīng)肉孢子蟲抗體結(jié)合的精確性和可靠性表明，肉孢子蟲免疫學(xué)研究進(jìn)入了重組抗原時(shí)代，這種重組肉孢子蟲抗原將有望用于相關(guān)疾病的診斷及疫苗的研制。

最近，我們看到Y(jié)eargan等人［19］對(duì)神經(jīng)肉孢子蟲ELISA試劑盒進(jìn)行的改進(jìn)研究報(bào)道。將現(xiàn)有的基于肉孢子蟲表面抗原SnSAG2、SnSAG3和SnSAG4的ELISA診斷試劑盒進(jìn)行了改良，制成了重組多價(jià)肉孢子蟲抗原的試劑盒，從而避免了因肉孢子蟲表面抗原多樣性及可變性帶來的診斷困難，提高了血清學(xué)診斷的可靠性。疫苗研制方面，Ellison等［20］用重組的神經(jīng)肉孢子蟲表面抗原1（recombinant surface antigens of S.neurona，rSnSAG1）制成的疫苗免疫馬，產(chǎn)生了相應(yīng)抗體，該抗體不僅對(duì)體外培養(yǎng)的裂殖子具有中和作用，而且能明顯減輕肉孢子蟲感染的臨床癥狀。

5 結(jié)語

近年來，肉孢子蟲免疫學(xué)研究飛速發(fā)展，取得了重大成果。我們相信，隨著抗原純化技術(shù)的進(jìn)步，肉孢子蟲免疫學(xué)診斷方法的準(zhǔn)確性將進(jìn)一步得到提高并形成標(biāo)準(zhǔn)化，使其更加廣泛地用于肉孢子蟲病的臨床診斷、療效考核以及流行病學(xué)調(diào)查。同時(shí)，肉孢子蟲基因重組抗原的研究和應(yīng)用不僅為改進(jìn)肉孢子蟲病的診斷提供了一條有效的途徑，還促進(jìn)了肉孢子蟲免疫保護(hù)性的研究，加速了疫苗研制的進(jìn)程。

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R392.1

B

1672－2639（2011）01－0015－03

2010－12－20；責(zé)任編輯 趙菊梅］

項(xiàng)目資助：國(guó)家自然科學(xué)基金（NO.30560022）