王 潔，夏振娜，車愛萍，袁伯俊，陸國才(第二軍醫(yī)大學(xué)新藥評(píng)價(jià)中心，上海 200433)

1987年美國國立衛(wèi)生研究院將生物標(biāo)志物定義為生物體或樣品可測(cè)出的由外來化合物導(dǎo)致的細(xì)胞學(xué)或生物化學(xué)組份過程、結(jié)構(gòu)或功能的變化［1］。毒理學(xué)生物標(biāo)志物是機(jī)體對(duì)化學(xué)物質(zhì)毒性劑量暴露后的生物學(xué)變化，可特異性地反映毒性效應(yīng)。據(jù)美國食品藥品管理局估計(jì)，約有30%的新藥就是因嚴(yán)重的安全性問題而導(dǎo)致研發(fā)失敗，故毒理學(xué)在新藥研發(fā)中起著越來越重要的作用，它可在創(chuàng)新藥物的研發(fā)早期，對(duì)所合成的系列新化合物實(shí)體進(jìn)行毒性篩選，從而發(fā)現(xiàn)和淘汰因毒性問題而不適于繼續(xù)研發(fā)的化合物，而生物標(biāo)志物能敏感有效地反映出生物體因藥物作用而發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷之前的生物變化，并能準(zhǔn)確評(píng)估生物體所處的不利狀態(tài)及其潛在危害，為可能發(fā)生的嚴(yán)重毒性損害提供早期警報(bào)，因此在新藥研發(fā)過程中，生物標(biāo)志物的作用功不可沒。本文討論新近發(fā)現(xiàn)的消化系統(tǒng)毒理學(xué)生物標(biāo)志物。

1 非腫瘤毒理學(xué)生物標(biāo)志物

1.1 胃腸道

1.1.1 腸脂肪酸結(jié)合蛋白 腸脂肪酸結(jié)合蛋白(intestinal fatty acid binding protein，I-FABP)是脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP)中的一種，僅存在于腸道黏膜，含量豐富，占細(xì)胞蛋白總量的2% ～3%，具有較好的器官特異性，可以作為缺血性腸炎的血漿生物標(biāo)志物。I-FABP在黏膜中的含量最豐富，絨毛處的含量高于陷窩處的含量［2］。由于黏膜層對(duì)缺血最為敏感，在腸缺血的早期或炎癥局限黏膜下層時(shí)，黏膜層就已有改變［3］。因此，黏膜層酶的釋放往往較肌層的酶早。在正常人血清中，I-FABP的含量微乎其微，當(dāng)藥物造成腸系膜血管收縮或內(nèi)臟血流量降低時(shí)，可引起缺血性腸炎，此時(shí)I-FABP能較早釋放，且在缺血時(shí)細(xì)胞膜的通透性較大，其分子可以通過細(xì)胞膜而釋放入血漿。當(dāng)腸道缺血發(fā)生后15 min血清中I-FABP迅速增加。大多數(shù)血清酶為熱不穩(wěn)定酶，測(cè)定時(shí)需保持酶的活性，而血清I-FABP在室溫下24 h相當(dāng)穩(wěn)定，可保持活性的95%，并且與傳統(tǒng)血清學(xué)指標(biāo)相比，I-FABP具有出現(xiàn)早、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。因此I-FABP是早期診斷藥物引起的腸缺血的敏感而特異性的指標(biāo)。

1.1.2 二胺氧化酶 二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)是人類和哺乳動(dòng)物小腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，在組胺和多種多胺代謝中起作用，其活性與黏膜細(xì)胞的核酸和蛋白合成密切相關(guān)，能夠反映腸道機(jī)械屏障的完整性和損傷程度。據(jù)相關(guān)報(bào)道［4］，血液中DAO的活性與小腸黏膜絨毛中DAO的活性以及由抗癌藥物引起的小腸黏膜損傷有顯著的相關(guān)性。Moriyama等［5］將大鼠分為抗癌藥物S-1組和FCD組。其中S-1組給予1-(2-四氫呋喃)-5-氟尿嘧啶、5-氯-2，4-二羥基吡啶和氧嗪酸鉀，3種藥物比率為1∶0.4∶1。FCD組給予1-(2-四氫呋喃)-5-氟尿嘧啶和5-氯-2，4-二羥基吡啶，兩種藥物比率為1∶0.4。氧嗪酸鉀為5-氟尿嘧啶引起胃腸黏膜損傷的保護(hù)劑。連續(xù)給藥7 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CD組大鼠空腸黏膜面積明顯小于S-1組，F(xiàn)CD組的大鼠血漿中DAO的活性比S-1組大鼠血漿中DAO的活性顯著降低。病理組織切片顯示，F(xiàn)CD組大鼠空腸黏膜的絨毛發(fā)生萎縮，但在S-1組并沒有觀察到此現(xiàn)象。因此DAO是一種非常敏感的血漿生物標(biāo)志物，在定量評(píng)價(jià)由5-氟尿嘧啶等癌癥藥物引起的小腸黏膜損傷中非常有用。

1.2 肝臟

1.2.1 ?；撬?肝毒性是藥物常見的不良反應(yīng)，當(dāng)毒性物質(zhì)對(duì)肝臟薄壁組織產(chǎn)生損傷時(shí)，肝細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡或壞死，胞漿酶如谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、山梨醇脫氫酶，有時(shí)線粒體標(biāo)記酶如鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(ornithine carbamoyltransferase，OCT)會(huì)被釋放進(jìn)入血液［6］。?；撬崾侨梭w內(nèi)含量最豐富的一種氨基酸。牛磺酸濃度的變化通常隨應(yīng)激狀態(tài)(如滲透壓的變化，缺氧，長(zhǎng)期照明光感受器，充血性心力衰竭，細(xì)胞增殖，或大腦發(fā)育等)的變化而變化。Ghandforoush和 Mashayekh［7］通過高效液相色譜法測(cè)定217名對(duì)乙酰氨基酚陽性患者和100名對(duì)乙酰氨基酚陰性患者以及90名正?；颊唧w內(nèi)的血漿?；撬釢舛?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予對(duì)乙酰氨基酚的患者的?；撬岬钠骄帩舛?26.4±1.6 mg/L)明顯高于對(duì)照組(5.6 ±0.2 mg/L)，因此藥物對(duì)肝臟有毒性時(shí)，肝臟合成牛磺酸增加，并從受損的肝細(xì)胞滲出，導(dǎo)致血漿和尿液中?；撬岬臐舛仍黾?。

1.2.2 山梨醇脫氫酶 山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase，SDH)可以氧化還原山梨醇，果糖以及NADH。它廣泛分布于機(jī)體的各個(gè)組織中，主要是存在于肝臟、腎臟和精囊的胞漿和線粒體中，在嚙齒類動(dòng)物以及人體中，它是表征急性肝損傷的具體指標(biāo)。由四氯化碳引起的肝小葉壞死、烯丙醇引起的門靜脈周圍壞死、α-荼基異硫氰酸鹽(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)引起的膽管壞死等可以用14種血清生化測(cè)試預(yù)測(cè)出來。谷氨酸脫氫酶(glutamic dehydrogenase，GLDH)、SDH、ALT 是這 14 種測(cè)試分析中最有價(jià)值的幾種［8］。GLDH和ALT的活性分析可以很好的預(yù)測(cè)由ANIT和烯丙醇引起的損害。SDH的活性是肝毒性的一個(gè)標(biāo)志，在評(píng)價(jià)2，3，7，8-四氯苯二噁英(tetrachlorodibenzodioxin，TCDD)對(duì)肝功能的影響中［9］，成年雄性恒河猴單劑量遞增法口服給予TCDD，每只恒河猴都用它自身的SDH、ALT和GGT做對(duì)照，時(shí)間為給藥前4周以及給藥后17周。SDH和ALT的活性在所有給予TCCD的動(dòng)物中都有提高。在另一項(xiàng)研究中［9］，比格犬劑量遞增法給藥殺撲磷(methidathion)，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的死亡以及不良的臨床癥狀，但在所有給予殺撲磷的比格犬中(雄性和雌性)，血清中膽汁酸和酶的活性(ALT，SDH和堿性磷酸酶)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加。因此SDH是一個(gè)臨床前肝毒性生物標(biāo)志物，血清SDH活性是否可以增加ALT活性有待進(jìn)一步研究。

2 腫瘤毒理學(xué)生物標(biāo)志物

由于個(gè)體差異的存在，某些藥物在體內(nèi)的代謝速率和代謝方式會(huì)有不同，對(duì)于目標(biāo)靶點(diǎn)的起效劑量也有不同，機(jī)體對(duì)藥物產(chǎn)生的反應(yīng)也不同，有些藥物及其代謝物可能會(huì)與DNA等靶點(diǎn)結(jié)合，產(chǎn)生基因毒性，并可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此血液中的蛋白質(zhì)和DNA可以作為驗(yàn)證藥物是否具有致癌性的生物標(biāo)志物。

2.1 肝臟

2.1.1 羧酸酯酶-2 羧酸酯酶-2(carboxylesterases-2，CE-2)是羧酸酯酶亞家族中的成員，由550個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為61 807。血清中的CE-2主要在肝臟中合成，并通過高爾基體分泌到血循環(huán)中。最近研究表明，CE-2可作為肝癌的新標(biāo)志物。肝臟惡性腫瘤患者血清中CE-2含量減少，而結(jié)腸癌及其它腫瘤患者血清中CE-2含量基本無改變［10］。CE-2在大腸癌組織表達(dá)量隨著病情的加重逐漸減少，但血清中CE-2的量和大腸癌病情無關(guān);其他腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、舌血管平滑肌肉瘤、非霍杰金淋巴瘤，血清中CE-2的量和正常人基本相似［10］。與此相反，肝癌患者血清中CE-2表達(dá)量比正常人顯著減少，提示肝癌病人血清中CE-2含量比正常人顯著減少可能是特異的，有望作為肝臟腫瘤特異的標(biāo)志物。

2.1.2 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)為公認(rèn)的致肝纖維化最主要的細(xì)胞因子之一，其貫穿肝纖維化的整個(gè)過程，主要由激活的肝枯否細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)等以自分泌、旁分泌的形式產(chǎn)生，可在局部形成高濃度。而正常肝組織一般無或僅有極少TGF-β1存在，在所有類型細(xì)胞中，TGF-β1均以無活性的形式合成和分泌，其活性形式為同源二聚體?；罨蟮腡GF-β1必須與其受體結(jié)合才能表現(xiàn)出相應(yīng)生物活性，如使肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)等［11］。在慢性肝炎、肝硬化組織中，由于病毒持續(xù)存在，引起免疫損傷和炎癥反應(yīng)，刺激間質(zhì)細(xì)胞分泌TGF-β1，它是最強(qiáng)的促纖維生成的細(xì)胞因子，不但參與維持HSC活化表型，而且刺激活化的HSC合成、分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)及ECM降解蛋白酶抑制劑，抑制ECM降解，增加ECM沉積。TGF-β1作用的結(jié)果是ECM的合成增多，導(dǎo)致肝纖維化形成。在57例肝硬化患者肝組織中［12］TGF-β1蛋白表達(dá)的陽性率為98.38%，而正常肝組織未見陽性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且TGF-β1表達(dá)的陽性信號(hào)均位于肝細(xì)胞胞漿中。

2.1.3 組織多肽特異性抗原 組織多肽特異性抗原(tissue polypeptide specific antigen，TPS)是從組織多肽抗原(tissue polypeptide antigen，TPA)中純化而來，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞角蛋白18片段上的M3決定簇，在細(xì)胞周期的S晚期和G2期，伴隨著DNA、蛋白質(zhì)的合成，TPS合成并于細(xì)胞分裂后不久釋放入血或體液中。所以血清TPS水平常反映腫瘤細(xì)胞的分裂增殖活性。研究發(fā)現(xiàn):TPS僅與腫瘤大小有關(guān)。Duller等［13］分別對(duì)69例肝細(xì)胞癌患者，57例健康人，56例慢性肝炎患者和49例肝硬化患者應(yīng)用單克隆TPS免疫放射分析法測(cè)定其血清TPS水平，同時(shí)還測(cè)定了甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)值。結(jié)果顯示:TPS血清水平僅高于正常對(duì)照組，與肝硬化及肝炎組無顯著差異;TPS與AFP無顯著相關(guān)性;血清TPS僅與腫瘤大小之間存在顯著相關(guān)性;AFP與腫瘤大小，門脈癌栓及腫瘤分化程度之間存在顯著相關(guān)性。血清TPS與肝細(xì)胞癌腫瘤侵襲性之間無顯著相關(guān)性。但與肝功能受損程度相關(guān)性顯著，導(dǎo)致在部分肝硬化患者或肝炎患者中出現(xiàn)了高水平表達(dá)。因此，TPS雖然尚不能夠獨(dú)立診斷肝細(xì)胞癌，但是對(duì)肝病患者血清TPS的升高應(yīng)注意結(jié)合其它相關(guān)的臨床指標(biāo)加以具體分析，以便能夠達(dá)到早期診斷肝細(xì)胞癌的目的。

2.2 胰腺

2.2.1 再生基因蛋白 Reg4(regenerating gene-4，Reg4)Reg4是再生基因家族成員之一，編碼17 kD的分泌性蛋白。Reg4基因是2001年由Har-tupee最先報(bào)道的基因，目前是Reg家族中最短小的一員，定位于染色體1p12～13-1，人類的Reg1和Reg3均定位于染色體2p12，但它們亦存在許多共同特性，如序列同源性，在組織表達(dá)上的相似性及內(nèi)含子－外顯子連接處基因結(jié)構(gòu)相似性等。Reg4基因由17 557個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成，包含7個(gè)外顯子及6個(gè)內(nèi)含子，由于差異剪接，外顯子并不表現(xiàn)在所有轉(zhuǎn)錄物中。Reg4的翻譯產(chǎn)物為158個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，包含一個(gè)22氨基酸的信號(hào)肽和一個(gè)保守的鈣依賴性的糖識(shí)別域［14］。Reg4蛋白分子量為17 kD，其氨基端呈高度疏水性，且包含一個(gè)含22氨基酸的信號(hào)序列。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)Reg家族成員進(jìn)行蛋白序列的比較顯示，Reg4與另外幾個(gè)成員 Reg1α，Reg1β和Reg3在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相似性均超過30%，三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果亦相似，說明4個(gè)成員在進(jìn)化上的保守性。Reg4可作用于相鄰的正常或腫瘤細(xì)胞，與細(xì)胞生存、再生、增殖和細(xì)胞黏附有關(guān)。Reg4在與腫瘤標(biāo)志物CA19-9相比的實(shí)驗(yàn)中［15］發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者的血清Reg4和CA19-9的AUC沒有顯著性差異。胰腺癌患者組和健康對(duì)照組相比，胰腺癌患者的血清Reg4水平要高于健康對(duì)照組。這表明血清Reg4可以作為診斷胰腺癌的一個(gè)有用指標(biāo)。

2.2.2 S100蛋白 S100蛋白存在于各種細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞分化等過程。S100家族屬于鈣離子結(jié)合蛋白，在分子結(jié)構(gòu)上具有共同的EF雙螺旋手性結(jié)構(gòu)，含有能與鈣離子高選擇性、高親和性結(jié)合的14個(gè)氨基酸序列，與鈣離子結(jié)合后通過鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)途徑可在細(xì)胞增殖、分化、肌肉收縮、基因表達(dá)、分泌及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［15］。S100家族共有23個(gè)成員，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上具有25% ～65%的同源性，為低分子質(zhì)量的酸性蛋白，因其可在100%中性飽和硫酸銨溶液中溶解而被命名為S100蛋白。S100蛋白基因位于4p16，它編碼的蛋白質(zhì)，除了與Ca2+結(jié)合外，還與Zn2+和Mg2+結(jié)合。S100蛋白是含有95個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，是在胎盤中分離發(fā)現(xiàn)的。從那以后，在胃癌、膽囊癌、膀胱上皮以及食管上皮的細(xì)胞分化中也同樣發(fā)現(xiàn)。Oliveira等［16］用反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)和原位雜交試驗(yàn)證明了有2%的胰腺上皮內(nèi)瘤-1A(pancreatic intraepithelial neoplasia-1A，PanIN-1A)，13% 的 PanIN-1B，31%的PanIN-2，43%的PanIN-3以及92%的侵襲性胰腺癌都有S100蛋白的表達(dá)。這表明S100蛋白的比例在逐漸增加，并且具有顯著性意義。而在正常的胰管中未發(fā)現(xiàn)有S100蛋白的表達(dá)。

2.3 口腔

血清糖蛋白YKL-40 YKL-40又名人類軟骨糖蛋白-39(human cartilageglycoprotein-39，HCgp-39)，是哺乳動(dòng)物18糖蛋白家族中的一員，是一種肝素和甲殼質(zhì)相結(jié)合的凝集酶。在生理?xiàng)l件下，YKL-40可由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞分泌，在炎癥相關(guān)性疾病特別是多種惡性腫瘤中，YKL-40有高水平的表達(dá)。近年來，YKL-40已被發(fā)現(xiàn)是一種潛在的腫瘤血清學(xué)新生物標(biāo)志物。可用于評(píng)估卵巢癌等多種人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。有研究證明，YKL-40的含量參數(shù)可以對(duì)肺、乳房、前列腺以及腎的癌變做出預(yù)測(cè)，對(duì)口腔癌變也有很好的預(yù)測(cè)作用。有實(shí)驗(yàn)對(duì)口腔癌患者以及健康的志愿者的血漿YKL-40水平做了如下分析:對(duì)56名口腔癌患者(35名男性，21名女性，平均年齡61.8歲)以及17名健康志愿者的血清YKL-40濃度作了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，口腔癌患者的YKL-40水平(平均199.01 mg/L)明顯高于健康志愿者［17］。Johansen 等［19，20］在13 種不同類型的腫瘤患者(2 500例)血清中發(fā)現(xiàn)，YKL-40比其它的腫瘤標(biāo)志物如表皮生長(zhǎng)因子受體2、癌胚抗原、上皮癌抗原、前列腺特異抗原和乳酸脫氫酶等具有更好的特異性。

3 展望

在新藥研發(fā)的各個(gè)階段發(fā)現(xiàn)和利用生物標(biāo)志物是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性研究。在臨床前和臨床研究中仍有很多藥物毒性靶器官缺乏良好的毒理學(xué)生物標(biāo)志物，因此當(dāng)務(wù)之急是結(jié)合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等前沿學(xué)科尋找到與藥物毒性靶器官相對(duì)應(yīng)的生物標(biāo)志物，對(duì)其進(jìn)行全面的評(píng)估，并盡快推廣應(yīng)用，這樣就可有效地減少藥物研發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［19，20］。

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