張 濤， 魏紀(jì)珍， 張麗麗， 陸 瓊， 梁革梅＊， 楊 朗

（1．廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004； 2．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 3．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，南寧 530007）

Bt毒蛋白與昆蟲中腸上皮細(xì)胞的刷狀緣膜囊泡（br ush bor der membrane vesicles，BBMV）上的一個(gè)或多個(gè)受體結(jié)合是其發(fā)揮毒性的關(guān)鍵［1］。已經(jīng)報(bào)道的受體蛋白主要有鈣黏蛋白（cadherin，CAD）、氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）、糖脂類碳水化合物、肌動(dòng)蛋白、堿性磷酸酯酶和V－ATP酶亞基A等，昆蟲對(duì)Bt產(chǎn)生抗性與其中腸的受體蛋白直接相關(guān)，受體蛋白的突變、表達(dá)量、結(jié)合能力的改變等是昆蟲對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗性的主要原因［2］。

APN是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的、在Bt毒素殺蟲機(jī)制中起作用的毒素受體蛋白。2002年Gill等采用顯微注射法獲得了含煙草天蛾（Manduca sexta）APN基因的轉(zhuǎn)基因黑尾果蠅（Drosophila mel anogaster）品系，APN在非敏感宿主果蠅中腸和中胚層獲得了表達(dá)，這種轉(zhuǎn)基因品系果蠅對(duì)Cry1 Ac毒素變得很敏感，該研究首次從蟲體水平證實(shí)APN可作為Cry1Ac毒蛋白的功能性受體［3］。Rajagopal等利用RNA干擾技術(shù)（RNAi）抑制斜紋夜蛾（Spodoptera litura）幼蟲中腸APN的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)可降低斜紋夜蛾對(duì)Bt的敏感性，證明APN是Bt毒素的受體，并與毒素蛋白發(fā)揮毒力有關(guān)［4］。

Vadla mudi等［5］首次報(bào)道了鈣黏蛋白是煙草天蛾中腸上皮組織中一種Cry1A的受體（BT－R1），能特異性地與Cry1 Ab結(jié)合。Nagamatsu等［6］將家蠶鈣黏蛋白BtR175在Sf9細(xì)胞系中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Bt R175的表達(dá)導(dǎo)致了膜對(duì)Cry1Aa滲透量的改變，進(jìn)一步證實(shí)了類鈣黏蛋白是Cry1Aa的一種受體。隨后的研究還表明，鈣黏蛋白不僅是毒素在鱗翅目昆蟲中腸上皮細(xì)胞上的特異性受體，還參與了啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［2，7－9］。

隨著轉(zhuǎn)Bt基因棉花在我國的大面積商業(yè)化種植，棉鈴蟲（Helicover paar migera）的危害得到了很好的控制［10］。但由于轉(zhuǎn)入的Bt基因在作物體內(nèi)持續(xù)表達(dá)，使得害蟲在整個(gè)生長周期都受到Bt殺蟲蛋白的高壓選擇，因而棉鈴蟲對(duì)Bt的抗性問題是影響未來轉(zhuǎn)基因棉花發(fā)展的關(guān)鍵因素。關(guān)于棉鈴蟲APN和CAD基因克隆、表達(dá)、及突變、缺失等變化與抗性的關(guān)系已經(jīng)進(jìn)行了一些研究，本文主要是利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，比較Bt抗性和敏感棉鈴蟲中腸兩種主要受體蛋白—鈣黏蛋白和氨肽酶N的表達(dá)量變化，分析受體蛋白表達(dá)量變化與抗性的關(guān)系，進(jìn)一步明確棉鈴蟲對(duì)Bt的抗性機(jī)制，為抗性治理策略的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 棉鈴蟲品系

敏感品系（96S）：1996年采自河南省新鄉(xiāng)棉田、在室內(nèi)用人工飼料飼養(yǎng)至今，期間未接觸任何殺蟲劑。

抗性品系（Bt R）：用Cry1Ac毒蛋白在室內(nèi)篩選了175代，相對(duì)抗性倍數(shù)為3 536．5倍。篩選方法見梁革梅等［11］。

棉鈴蟲在溫度（27±2）℃，相對(duì)濕度（75±10）%，光周期L∥D＝14 h∥10 h的條件下飼養(yǎng)。幼蟲在指形管中用人工飼料飼養(yǎng)，人工飼料配方參照梁革梅等［12］方法，成蟲在產(chǎn)卵籠中用10%糖水補(bǔ)充營養(yǎng)。

1．2 試劑和儀器設(shè)備

主要試劑：RNA分離試劑（Trizol）、DNA酶試劑盒和c DNA合成試劑盒購自美國Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR及常規(guī)PCR試劑購自大連寶生物公司（Ta Ka Ra）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems Incorporation，ABI）公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司（BIO－RAD Corporation）；5417R 冷凍離心機(jī)，德國艾本德（Eppendorf Cor poration）公司。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 棉鈴蟲總RNA的提取

由于1、2、3齡棉鈴蟲的蟲體較小，取整頭幼蟲備用；解剖4、5齡棉鈴蟲幼蟲，截取中腸，用生理鹽水（0．7%）沖洗干凈后，用吸水紙將液體吸干。所有樣品立即放入液氮中，之后置－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用多頭提取方法，每個(gè)齡期棉鈴蟲所用幼蟲頭數(shù)分別為：1齡80頭，2齡40頭，3齡15頭，4齡15頭，5齡10頭。試驗(yàn)重復(fù)3次。

用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取棉鈴蟲總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，用分光光度計(jì)檢測其純度并定量，－80℃保存。

1．3．2 cDNA的合成

先用DNaseⅠ去除RNA中的基因組DNA，再根據(jù)Invitrogen公司的Super ScriptⅢFirst－Strand試劑盒操作說明合成c DNA。

1．3．3 常規(guī)PCR模板檢測

取經(jīng)過消化后的RNA和反轉(zhuǎn)錄得到的c DNA分別用Actin引物進(jìn)行常規(guī)PCR，以證明RNA中無基因組DNA污染和反轉(zhuǎn)錄得到的c DNA符合試驗(yàn)要求。

Actin－F：5′－CATCTACGAGGGTTACGC－3′，Tm 50．8℃；

Actin－R：5′－CATCTGTTGGAAGGTGGA－3′，Tm 50．8℃。

擴(kuò)增長度574 bp，由Invitr ogen公司合成。

PCR反應(yīng)：模板1μL，加入10×Ex Taq緩沖液5μL（含 Mg2＋），正向和反向引物各1μL（10μmol／L），d NTP 4μL（2．5 mmol／L），Ex Taq DNA 聚合酶0．25μL（5 U／μL），加水至50μL，混勻。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳查看結(jié)果。

1．3．4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real－ti me quantitative PCR，Rq－PCR）

引物及探針合成：參考Gen Bank登錄號(hào)分別為AF519180、AF441377和X97615的CAD、APN1和actin基因全長設(shè)計(jì)引物。以actin為內(nèi)參基因。采用Taq Man技術(shù)進(jìn)行熒光定量PCR。探針5′端為FA M標(biāo)記，探針3′端為Eclipse標(biāo)記。q RT－PCR上游引 物 （f or war d pri mer－F）、下 游 引 物 （reverse pri mer－R）、探針（probe－P）設(shè)計(jì)序列見表1。所需引物及探針由大連寶生物公司合成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物及探針序列

Rq PCR反應(yīng)體系：在冰上配制25μL反應(yīng)體系，包括Premix Ex Taq 12．5μL，滅菌蒸餾水（dd H2O）8．7μL，正向和反向引物各1μL（10μmol／L），ROX Reference DyeⅡ（50×）0．4μL，熒光探針溶液0．4μL，c DNA 1μL，振蕩器混勻。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)探針設(shè)3個(gè)空白對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次。

RqPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性1 min；95℃5 s，60℃25 s，40個(gè)循環(huán)；60℃25 s期間收集熒光信號(hào)。

RqPCR引物擴(kuò)增效率檢驗(yàn)：以96S的c DNA為模板，初始濃度定為1，加水稀釋5、10、50、100、500、1 000倍，得到濃度分別為0．2、0．1、0．02、0．01、0．002、0．001，加上初始濃度，共7個(gè)不同濃度的c DNA模板。以此c DNA模板，按照上述實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序配制反應(yīng)液，每個(gè)模板設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)基因設(shè)4個(gè)空白對(duì)照。

1．4 數(shù)據(jù)分析

表達(dá)量的計(jì)算參考Livak和Schmittgen［13］的方法，即2－△△CT法：首先，對(duì)所有測試樣本和校正樣本，用目的基因的CT值減去內(nèi)參基因的CT值，△CT＝目的基因CT－內(nèi)參基因CT。然后，用校正樣本的△CT值歸一試驗(yàn)樣本的△CT值，△△CT＝樣本的△CT－參照的△CT。最后，計(jì)算基因表達(dá)量比率，2－△△CT＝樣本表達(dá)量比值。分別以96S品系1齡幼蟲的CAD和APN1的表達(dá)量為1進(jìn)行比較。同一齡期抗、感棉鈴蟲表達(dá)量的差異比較采用t測驗(yàn)；同一品系、不同齡期間的比較采用兩因素方差分析，用LSD法進(jìn)行多重比較。用DPS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 探針可靠性驗(yàn)證

根據(jù)反應(yīng)導(dǎo)出的數(shù)據(jù)，以△CT（目的基因CAD＼APN1的CT值減去內(nèi)參基因actin的CT值）為Y軸，以不同稀釋濃度的c DNA模板的－lg值為X軸作圖，“C”為c DNA的相對(duì)濃度，進(jìn)行探針可靠性驗(yàn)證。結(jié)果表明：CAD（－0．002 8）和APN1（0．020 5）的方程

斜率的絕對(duì)值都小于0．1，符合試驗(yàn)要求，證明試驗(yàn)所 設(shè)計(jì)的探針符合熒光定量PCR試驗(yàn)要求（圖1）。

圖1 CAD、APN1與β－actin探針可靠性驗(yàn)證

2．2 不同齡期抗、感棉鈴蟲CAD表達(dá)量的比較

圖2顯示了抗、感棉鈴蟲CAD的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明：與敏感品系相比，抗性品系的1齡、2齡棉鈴蟲CAD表達(dá)量明顯降低（p值分別為0．002、0．007 3），差異達(dá)到極顯著水平；但抗、感品系3齡、5齡幼蟲CAD的表達(dá)量差異不顯著（p值分別為0．92、0．53）；抗性品系4齡幼蟲的CAD表達(dá)量反而略高于敏感品系，差異達(dá)到顯著水平（p＝0．022）。但整體比較抗、感品系棉鈴蟲幼蟲的CAD表達(dá)量，抗性品系幼蟲的CAD表達(dá)量顯著降低，差異極顯著（p＜0．001）。

圖2 抗、感品系棉鈴蟲的CAD相對(duì)表達(dá)量

不同齡期的棉鈴蟲幼蟲CAD表達(dá)量差異也極顯著（表2）。在敏感品系96S中，1齡幼蟲CAD的表達(dá)量最高，其次是2齡、5齡幼蟲，3齡、4齡幼蟲的表達(dá)量最低；而在抗性品系中各齡期幼蟲CAD表達(dá)量由高到低的順序?yàn)椋?齡＞5齡＞4齡＞3齡＞2齡，其中4齡、3齡、2齡間差異不顯著。

表2 不同齡期棉鈴蟲幼蟲CAD表達(dá)量的比較1）

2．3 不同齡期抗、感棉鈴蟲APN1表達(dá)量的比較

抗、感棉鈴蟲APN1的相對(duì)表達(dá)量如圖3所示，結(jié)果表明：與敏感品系相比，抗性品系的2齡棉鈴蟲APN1表達(dá)量明顯降低（p＝0．003 6），差異達(dá)到極顯著水平；但抗、感品系1齡、3齡、5齡幼蟲APN1的表達(dá)量差異不顯著（p值分別為0．057、0．996 8、0．647 9）；抗性品系4齡幼蟲的 APN1表達(dá)量反而略高于敏感品系，差異達(dá)到顯著水平（p＝0．012）。但比較抗、感品系1齡～5齡棉鈴蟲幼蟲整體APN1的表達(dá)量，抗性品系幼蟲的APN1表達(dá)量顯著低于敏感品系，差異達(dá)到極顯著（p＜0．001）。

圖3 抗、感品系棉鈴蟲的APN1相對(duì)表達(dá)量

不同齡期的棉鈴蟲幼蟲APN1表達(dá)量差異也極顯著（表3）。在敏感品系96S中，1齡、2齡幼蟲APN1的表達(dá)量明顯高于其他齡期幼蟲，其次是5齡幼蟲，3、4齡幼蟲的表達(dá)量最低；而在抗性品系中各齡期幼蟲APN1表達(dá)量由高到低的順序?yàn)椋?齡＞5齡＞4齡＞2齡＞3齡，各齡期間差異都達(dá)到極顯著。

表3 不同齡期棉鈴蟲幼蟲APN1表達(dá)量的比較1）

3 討論

CAD的表達(dá)量及其分布在不同昆蟲、不同時(shí)期是不同的，而且由于抗性的產(chǎn)生可能會(huì)造成表達(dá)量的不穩(wěn)定。如Midboe等發(fā)現(xiàn)，BT－R（鈣黏蛋白）只在煙草天蛾幼蟲期表達(dá)，在卵和成蟲期不表達(dá)，幼蟲的不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量也不同，表達(dá)量隨著幼蟲蟲齡增長而增加［18］；王桂榮等運(yùn)用RT－PCR技術(shù)，分析了鈣黏蛋白基因在棉鈴蟲敏感品系不同組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)鈣黏蛋白主要在棉鈴蟲中腸表達(dá)，在前、后腸表達(dá)量很低，在腸道以外的組織中不表達(dá)［19］；Carriére等利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析棉紅鈴蟲［Pectinophor a gossy piell a （Saunders）］的鈣黏蛋白基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)鈣黏蛋白在幼蟲期表達(dá)量最高，在成蟲和胚胎中也都表達(dá)，在敏感棉紅鈴蟲所有時(shí)期的表達(dá)都比較穩(wěn)定，但抗性品系Bt R 1齡～3齡幼蟲的表達(dá)量最高，其次是4齡幼蟲和成蟲，在蛹和胚胎中表達(dá)量最低，且4齡幼蟲前腸和中腸表達(dá)量最高［20］。作者的試驗(yàn)結(jié)果顯示，不僅抗性棉鈴蟲的CAD表達(dá)量不穩(wěn)定，而且敏感品系棉鈴蟲的CAD表達(dá)量也不穩(wěn)定，1齡幼蟲的表達(dá)量最高，其次是2齡、5齡幼蟲，3齡、4齡表達(dá)量最低，抗性品系還表現(xiàn)為表達(dá)量提前降低。這進(jìn)一步說明了不同齡期幼蟲CAD表達(dá)量的變化趨勢在不同昆蟲間差異較大。

APNs在不同昆蟲、不同時(shí)期體內(nèi)的分布及其表達(dá)量也是不同的，如蘋淺褐卷蛾（Epip hyas postvittana）已被分離的5個(gè)APN基因在整個(gè)幼蟲期都表達(dá)，表達(dá)量隨齡期的增大而增加，且中腸中的表達(dá)量最高［14］；Angelucci等測量了棉鈴蟲中腸APN的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)APN1－APN4也在棉鈴蟲的整個(gè)幼蟲期都表達(dá)［15］；Crava等測定了歐洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）幼蟲期 APN的mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)APN在幼蟲各個(gè)齡期都表達(dá)，5齡幼蟲中APNs主要在中腸表達(dá)［16］。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，比較了不同齡期棉鈴蟲幼蟲的APN1表達(dá)量，也發(fā)現(xiàn)APN1在敏感品系1齡～5齡幼蟲期都表達(dá)，但表達(dá)量隨齡期的增加呈現(xiàn)“V”字形變化，1齡、2齡幼蟲的表達(dá)量最高，3齡、4齡時(shí)顯著降低，到5齡時(shí)表達(dá)量又有所增加。造成這種結(jié)果的原因還需要進(jìn)一步分析。

雖然抗性品系不同齡期棉鈴蟲的APN1表達(dá)量變化趨勢與敏感品系相近，但表現(xiàn)為表達(dá)量提前降低，與1齡幼蟲相比，2齡幼蟲的表達(dá)量顯著降低，2齡、3齡幼蟲的表達(dá)量最低，4齡、5齡又逐漸升高。Chougule等曾報(bào)道，取食不同飼料會(huì)造成棉鈴蟲APNs表達(dá)量的差異［17］，所以我們分析抗性品系棉鈴蟲一直取食含Bt毒蛋白的飼料，可能是造成APN1表達(dá)量提前降低的主要原因。

鈣黏蛋白和APNs的表達(dá)量與抗性存在明顯相關(guān)性，已先后通過PCR、Norther n blot、RNAi等技術(shù)在不同昆蟲中得到了證實(shí)。如王桂榮等利用RTPCR技術(shù)比較了抗、感棉鈴蟲CAD的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲對(duì)Cr y1 Ac產(chǎn)生抗性后，鈣黏蛋白的表達(dá)量明顯降低［19］；Carriére等利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了棉紅鈴蟲抗性品系鈣黏蛋白表達(dá)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象［20］；Herrero等通過Nort her n blot比較了甜菜夜蛾（Spodopter a exigua）的APNs表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)APN1在抗性昆蟲中不表達(dá)，說明APN1的不表達(dá)與甜菜夜蛾對(duì)Cry1Ca的抗性相關(guān)［21］；Rajagopal等構(gòu)建了斜紋夜蛾的ds RNA，并將其注入5齡幼蟲的血淋巴中，干擾了APN基因的RNA轉(zhuǎn)錄，48 h后處理組幼蟲APN的表達(dá)比對(duì)照組減少了80%，而LC50提高了70%，證明APN的表達(dá)量與幼蟲的敏感性是顯著相關(guān)的［4］；Yang等［22］發(fā)現(xiàn) Cry1 Ab抗性小蔗螟品系中，APN1、APN2和APN3的表達(dá)量相對(duì)于敏感品系都有不同程度的下降；利用RNAi技術(shù)降低敏感昆蟲體內(nèi)3種APN的表達(dá)量后，敏感性伴隨著APN表達(dá)量的下降而出現(xiàn)了下降。

作者的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)抗性品系棉鈴蟲的CAD和APN1表達(dá)量都明顯降低，尤其是1、2齡幼蟲時(shí)表現(xiàn)明顯，抗、感品系差異極顯著。這也再次證明了昆蟲中腸的鈣黏蛋白、APN表達(dá)量的下降與抗性相關(guān)。但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抗性品系4齡棉鈴蟲幼蟲的APN1和CAD表達(dá)量反而比敏感品系高，這可能與抗性品系幼蟲一直取食含Bt的飼料有關(guān)。本研究在試驗(yàn)中采用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法測定APN1和CAD的表達(dá)量，比以前采用其他方法測定的結(jié)果具有更好的即時(shí)性、良好的重復(fù)性、特異性及準(zhǔn)確性。這些結(jié)果將為我們進(jìn)一步了解APN和CAD的功能及與抗性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

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