聶毅磊，王傳喜，鄭永標，林 如，許麗艷，彭 飛，方東升，連云陽，江 紅*

1福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福州350007; 2福建師范大學生命科學院，福州350108;3汕頭大學醫(yī)學院，汕頭515041

海綿共附生疣孢菌FIM06031細胞毒活性代謝產(chǎn)物的研究

聶毅磊1，王傳喜1，鄭永標2，林 如1，許麗艷3，彭 飛1，方東升1，連云陽1，江 紅1*

1福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福州350007;2福建師范大學生命科學院，福州350108;3汕頭大學醫(yī)學院，汕頭515041

利用正相硅膠、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20和反相C18柱層析等方法，從海綿共附生疣孢菌FIM06031的發(fā)酵菌絲體提取液中分離到三個化合物(1～3)。通過波譜方法鑒定其中一個化合物harrucomicin C(1)為新倍半萜，另外兩個已知化合物為cyperusol C(2)和Nb-乙酰色胺(3)。活性研究表明harrucomicin C對腫瘤細胞株HepG2、EC109和HeLa具顯著增殖抑制活性，其IC50值分別為16.99、25.33 μM和34.64 μM;cyperusol C對腫瘤細胞HeLa和HepG2增殖抑制作用的IC50值分別為149.99 μM和167.78 μM。

疣孢菌;細胞毒活性;Harrucomicin C;倍半萜;Cyperusol C

長期以來鏈霉菌是篩選抗腫瘤藥物的主要來源菌［1-3］，但隨著大多數(shù)鏈霉菌菌株被反復研究，從中發(fā)現(xiàn)新藥物的機率在逐漸降低，因而，人們把開發(fā)新菌源作為尋找新抗腫瘤藥物的重要突破口。海洋環(huán)境特殊，海洋放線菌產(chǎn)生的抗生素具有結構多樣及活性獨特的特點［4-6］。

疣孢菌(Verrucosispora)屬于放線菌目小單孢菌科(Micromonosporaceae)。目前分離到的該屬菌種較少，對疣孢菌次生代謝產(chǎn)物的研究報道更少，已報道的該屬三個菌株分別產(chǎn)生結構新穎的抗菌化合物abyssomicin C［7］、抗腫瘤化合物proximicins A-C［8］和雄激素拮抗劑gifhornenolones A-B［9］。

我們采取選擇性分離方法從福建莆田平海海域的海綿中，分離到幾十株放線菌，基于16S rRNA基因序列的分子分類鑒別這些菌株屬于疣孢菌屬，選取其中一株初篩具顯著抑制腫瘤細胞作用的疣孢菌FIM06031為研究對象，研究其腫瘤細胞毒活性代謝產(chǎn)物。從FIM06031的發(fā)酵菌絲體提取液中分離得到三個化合物(1～3)，包括一個新倍半萜harrucomicin C(1)，其對腫瘤細胞株HepG2，EC109和HeLa具顯著增殖抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器材料

Beckman J-20xp離心機;硅膠GF254薄層層析板(青島海洋化工廠);柱層析用硅膠(100～200目);凝膠Sephadex LH-20(Phammacia);反相硅膠RP-18 (Merck);API QSTAR Pulsar i System質譜儀;Bruker AV-400超導核磁共振波譜儀(TMS作為內標，δ為ppm，J為Hz);所用試劑均為分析純。

1.1.2 實驗菌株和細胞株

疣孢菌FIM06031，福建省微生物研究所菌種資源庫保存，作為專利菌種保藏于中國微生物菌種保藏中心，編號:CGMCC NO.3924。

實驗細胞株HepG2(肝癌細胞)、EC109(食管癌細胞)和HeLa(宮頸癌細胞)由汕頭大學醫(yī)學院提供，均為國際通用的腫瘤細胞株。

1.1.3 種子培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(%):可溶性淀粉1.5，葡萄糖0.5，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，MgSO4·7H2O 0.05，NaCl 0.05，(NH4)2SO40.05，CaCO30.1，自來水配制，pH 7.8(滅菌前)。

1.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(%):可溶性淀粉4.0，葡萄糖0.5，黃豆餅粉 2.5，酵母粉 0.5，MgSO4·7H2O 0.05，K2HPO40.05，CaCO30.1，50%陳海水配制，pH 7.8(滅菌前)。

1.2 方法

1.2.1 菌株FIM06031的發(fā)酵

取一鉑環(huán)菌株FIM06031淀粉天冬素瓊脂斜面培養(yǎng)物接入種子培養(yǎng)基，35℃，240 rpm/min培養(yǎng)45 h;10%移種量轉入30 L發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，240 rpm/min振蕩培養(yǎng)96～120 h。

1.2.2 成分的提取

FIM06031菌株發(fā)酵液(30 L)4500 rpm/min離心15 min后獲得的菌絲體用95%乙醇(10 L)浸泡1 d，浸泡液減壓濃縮去除乙醇。濃縮液用乙酸乙酯(6 L)萃取，減壓濃縮得膏狀提取物(13.5 g)。

1.2.3 化合物的分離和純化

膏狀提取物(13.5 g)行正相硅膠柱層析，洗脫劑采用環(huán)己烷∶丙酮=2∶1，分段收集洗脫液。硅膠薄層層析(TLC)(二氯甲烷∶甲醇=5∶1)檢測，硫酸-乙醇(5∶95)顯色，105℃烘烤，合并相同組份，得到組份A(2.9 g)和組份B(2.5 g);組份A行反相C18色譜柱層析(甲醇∶水=50∶100)，分段收集洗脫液，合并相同組份，得到組份A1(0.7 g);A1經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，合并得到組份A11(0.4 g);A11經(jīng)正相硅膠柱層析，洗脫劑采用石油醚∶丙酮=1∶1，分段收集洗脫液，TLC檢測，在Rf值約0.6左右處有粉紅色轉黑色斑點，合并獲得化合物1(3 mg)，在Rf值約0.4左右處有粉紅色轉黑色斑點，合并獲得化合物2(4 mg);組份B(2.5 g)經(jīng)反相C18色譜柱層析(甲醇∶水=75∶100)，分段收集洗脫液，合并得到組份B1(0.6 g);B1行正相硅膠柱層析，洗脫劑采用石油醚∶丙酮=3∶1，分段收集洗脫液，TLC檢測，在Rf值約0.7左右處有黃色斑點，合并獲得化合物3(8 mg)。

1.2.4 MTT法［10］測定化合物細胞毒活性

分別取對數(shù)生長期的HepG2(肝癌細胞)、EC109(食管癌細胞)和HeLa(宮頸癌細胞)，調整細胞濃度至1×105～4×105個/mL，取100 μL接種于96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)孔內的培養(yǎng)基吸凈，每孔加入100 μL相應濃度的含藥物的培養(yǎng)液，每一樣品設三平行組，同時設空白，陽性對照為氟尿嘧啶(5-氟-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮)，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，加入MTT液(5 mg/mL)10 μL，繼續(xù)孵育3～4 h，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩使結晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀(λ=570 nm)上測定各孔的光吸收值。

2 結果與討論

2.1 化合物結構鑒定

通過正相硅膠、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20和反相C18柱層析，共分離到3個化合物，根據(jù)NMR以及MS數(shù)據(jù)分別鑒定為harrucomicin C(1)、cyperusol C(2)和Nb-乙酰色胺(3)?；瘜W結構式見圖1:

圖1 化合物1～3的結構Fig.1 Structures of compounds 1-3

化合物1 白色無定形粉末。溶于甲醇，丙酮，乙酸乙酯等有機溶劑。［α］23D+14.2(c 0.2，MeOH);HR-ESI-MS m/z:379.2249［M+Na］+(calcd for 379.2351)，確定分子式為C23H32O3，計算其不飽和度為8。1H NMR(CD3OD，400 MHz)，在低場區(qū)顯示有5個芳環(huán)質子信號δ:7.27(5H，m)，同時碳譜中6個信號δ:135.9(s)，130.4(d，×2)，129.5(d，×2)，128.1(d)，進一步證實了單取代苯環(huán)的存在。比較化合物1和已知化合物cyperusol C (2)的1H及13C NMR數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，1除多出一個單取代的苯環(huán)信號外，在氫譜上多了一個亞甲基氫信號δ 3.61(2H，s)，在碳譜上多了兩個碳信號δ 173.3和δ 42.6。分析HSQC圖譜，發(fā)現(xiàn)δ 3.61(2H，s)與δ 42.6相關，HMBC圖譜中δ 3.61(2H，s，H-2')質子信號與δ 173.3(C-1')、δ 135.9(C-3')和δ 130.4 (C-4')碳信號相關，結合分子式推測1可能比2多了一個苯乙酰基。比較兩個化合物的氫譜，發(fā)現(xiàn)1中H-1位質子信號(δ 4.51)與化合物2(δ 3.23，H-1)的化學位移相差較大，推測苯乙?；赡苓B在C-1位羥基上。HMBC圖譜中δ 4.51(H-1)與δ 173.3 (C-1')的相關，進一步證實了這一推斷，化合物1的平面結構由此確定。

1的相對構型通過ROESY圖譜確定，在ROESY圖譜中可以看到信號H-1與Hα-3、H-5相關，H-5與H-7相關，H-14與H-15相關。與文獻［11］報道的核磁數(shù)據(jù)對比進一步驗證了化合物1的相對構型(見圖1)。經(jīng)SciFinder和INSPEC等數(shù)據(jù)庫檢索，未發(fā)現(xiàn)相關報道，表明這是一個新的化合物，命名為harrucomicin C。主要二維相關見圖2。并對其核磁數(shù)據(jù)進行了歸屬。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ: 4.51(1H，dd，J=10.4，4.8 Hz，H-1)，1.68(1H，m，Hα-2)，1.62(1H，m，Hβ-2)，1.75(1H，ddd，J= 12.0，3.5，3.0，Hz，Hβ-3)，1.57(1H，ddd，J=13.5，12.0，3.5 Hz，Hα-3)，1.36(1H，m，H-5)，1.86(1H，m，Hα-6)，1.22(1H，m，Hβ-6)，1.88(1H，m，H-7)，1.45(1H，m，Hα-8)，1.30(1H，dddd，J=17.0，13.5，13.0，3.5 Hz，Hβ-8)，1.43(1H，ddd，J=13.5，3.5，3.5 Hz，Hβ-9)，1.04(1H，ddd，J=13.5，13.0，4.0 Hz，Hα-9)，4.69(2H，d，J=6.5 Hz，H-12)，1.71 (3H，s，H-13)，0.90(3H，s，H-14)，1.08(3H，s，H-15)，3.61(2H，s，H-2')，7.27(5H，m，H-3'-8');13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:82.9(d，C-1)，26.1(t，C-2)，41.3(t，C-3)，72.0(s，C-4)，54.2(d，C-5)， 26.8(t，C-6)，47.2(d，C-7)，27.5(t，C-8)，41.6 (t，C-9)，39.5(s，C-10)，151.6(s，C-11)，108.9 (t，C-12)，21.1(q，C-13)，14.5(q，C-14)，22.5 (q，C-15)，173.3(s，C-1')，42.6(t，C-2')，135.9 (s，C-3')，130.4(d，C-4')，129.5(d，C-5')，128.1 (d，C-6')，129.5(d，C-7')，130.4(d，C-8')。

圖2 Harrucomicin C的主要1H-1H COSY，HMBC和ROESY相關Fig.2 Key1H-1H COSY，HMBC and ROESY correlations for Harrucomicin C

化合物2 無色油狀物。溶于甲醇，丙酮，乙酸乙酯等有機溶劑。［α–31.5(c 1.0，MeOH) APCI-MS(大氣壓化學電離質譜)m/z:238.5［M］+。HR-EI-MS m/z:238.1934［M］+(calcd for 238.1933)確定分子式為 C15H26O2。1H NMR (CD3OD，400 MHz)δ:3.23(1H，dd，J=11.2，4.4 Hz，H-1)，1.64(2H，m，H-2)，1.72(1H，ddd，J= 12.0，3.5，3.0 Hz，Hβ-3)，1.52(1H，ddd，J=13.5，12.0，3.5 Hz，Hα-3)，1.28(1H，m，H-5)，1.86(1H，m，Hα-6)，1.24(1H，m，Hβ-6)，1.90(1H，m，H-7)，1.56(1H，m，Hα-8)，1.38(1H，dddd，J=17.0，13.5，13.0，3.5 Hz，Hβ-8)，1.94(1H，ddd，J=13.5，3.5，3.5 Hz，Hβ-9)，1.13(1H，ddd，J=13.5，13.0，4.0 Hz，Hα-9)，4.69(2H，m，H-12)，1.74(3H，s，H-13)，0.88(3H，s，H-14)，1.08(3H，s，H-15);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:80.3(d，C-1)，29.4(t，C-2)，41.9(t，C-3)，72.4(s，C-4)，54.1(d，C-5)，27.1(t，C-6)，47.5(d，C-7)，27.8(t，C-8)，42.0 (t，C-9)，40.3(s，C-10)，151.8(s，C-11)，108.9 (t，C-12)，21.2(q，C-13)，13.8(q，C-14)，22.6 (q，C-15)?；衔?的相對構型通過ROESY圖譜確定，在ROESY圖譜中可以看到信號H-1與H-3、H-5相關，H-5與H-7相關，H-14與H-15相關。通過與文獻［11］報道的核磁數(shù)據(jù)對比進一步驗證了化合物2為cyperusol C。

化合物3 淡黃色油狀物。UV λmax(MeOH) nm:218，280。ESI-MS m/z:203［M+H］+，225［M +Na］+結合氫譜和碳譜確定分子式為 C12H14N2O。1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:8.14(1H，brs，NH-1)，7.04(1H，d，J=2.2 Hz，H-2)，7.60(1H，d，J=8.0 Hz，H-4)，7.13(1H，dd，J=8.0，8.0 Hz，H-5)，7.21(1H，dd，J=8.0，8.0 Hz，H-6)，7.38(1H，d，J=8.0 Hz，H-7)，2.98(2H，t，J=6.5 Hz，H-10)，3.60(2H，dt，J=6.5，6.0 Hz，H-11)，5.53(1H，brs，NH-12)，1.92(3H，s，H-14);13CNMR (CD3OD，100 MHz)δ:122.3(d，C-2)，113.3(s，C-3)，119.2(d，C-4)，119.6(d，C-5)，123.3(d，C-6)，112.2(d，C-7)，138.2(s，C-8)，128.8(s，C-9)，26.2(t，C-10)，41.5(t，C-11)，173.2(s，C-13)，22.6(q，C-14)。與文獻［12］報道的核磁數(shù)據(jù)對比進一步確定了化合物3為Nb-乙酰色胺。

2.2 細胞毒活性

Harrucomicin C(1)對腫瘤細胞HepG2，EC109和HeLa具有顯著增殖抑制活性，其IC50值分別為16.99 μM、25.33 μM和34.64 μM;cyperusol C(2)對腫瘤細胞HeLa和HepG2也具增殖抑制活性，其IC50值分別為149.99 μM和167.78 μM。

2.3 討論

從海綿共附生疣孢菌FIM06031的發(fā)酵菌絲體提取液中分離到三個代謝產(chǎn)物harrucomicin C，cyperusol C和Nb-乙酰色胺。其中harrucomicin C為新的具有顯著腫瘤細胞增值抑制活性的倍半萜，對其作用機理值得進一步的研究，同時預示疣孢菌是產(chǎn)生新生物活性次生代謝產(chǎn)物的重要菌株來源，值得進一步的研究。由于疣孢菌FIM06031的發(fā)酵菌絲體中harrucomicin C含量微量，樣品制備困難，發(fā)酵條件值得進一步優(yōu)化。Cyperusol C是2004年Xu FM等［11］首次從中藥Cyperus longus中分離到，2010年Shirai M等［9］從一株疣孢菌中也分離到該化合物;Nb-乙酰色胺是2003年Li Y等［12］從海綿共附生的真菌中分離到。

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Novel Secondary Metabolites with Cytotoxic Activities Produced by Verrucosispora sp.FIM06031 from Marine Sponge

NIE Yi-lei1，WANG Chuan-xi1，ZHENG Yong-biao2，LIN Ru1，XU Li-yan3，PENG Fei1，F(xiàn)ANG Dong-sheng1，LIAN Yun-yang1，JIANG Hong1*1Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，F(xiàn)ujian institute of microbiology，F(xiàn)uzhou 350007，china;2Life sciences College of Fujian Normal Univesity，F(xiàn)uzhou 350108，china;3Shantou University Medical College，Shantou 515041，china

Three compounds(1-3)were isolated from culture broth of Verrucosispora sp.FIM06031 from marine sponge by silica gel，sephadex LH-20 and C18reversed phase column chromatography.On the basis of spectral data，they were identified as a novel sesquiterpenoid harrucomicin C(1)，cyperusol C(2)，and Nb-acetyltryptamine(3).Compound 1 showed prominent growth inhibitory activity against the tumor cell lines HepG2，EC109 and HeLa with IC50values of 16.99，25.33 μM and 34.64 μM，respectivity in vitro by MTT assay，while 2 showed growth inhibitory activity against HeLa and HepG2 cells with IC50values of 149.99 μM and 167.78 μM，respectively.

Verrucosispora;cytotoxic activity;harrucomicin C;sesquiterpenoid;cyperusol C

1001-6880(2011)05-0797-04

2011-04-20 接受日期:2011-07-29

國家“十一五”重大專項(2010ZX09401-403);福建省自然科學基金項目(2011J01092);福建省重點項目(2009R10003-1)

*通訊作者 Tel:86-591-83475544;E-mail:jianghong709@yahoo.com.cn

R284.2

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