劉小銳，計(jì)巧靈，苗書魁，邢思雷

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊830046

提取工藝和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)羅布麻愈傷組織中黃酮含量的影響

劉小銳，計(jì)巧靈*，苗書魁，邢思雷

新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊830046

以羅布麻愈傷組織粉末為材，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法對(duì)羅布麻愈傷組織中黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)曲面分析結(jié)果表明，提取試劑和提取溫度對(duì)提取的黃酮含量存在顯著影響。通過響應(yīng)曲面分析得到羅布麻愈傷組織中黃酮提取的最佳條件為:提取試劑為70%甲醇，物料比1∶40，提取時(shí)間為4 h，提取溫度為70℃。培養(yǎng)并比較了30種不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度與配比誘導(dǎo)100 d生長(zhǎng)的愈傷組織中黃酮的含量，結(jié)果得出MB+KT(1.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)上培養(yǎng)約100 d的愈傷組織中黃酮含量最高，為73.90 mg/g。測(cè)定愈傷組織培養(yǎng)30 d內(nèi)黃酮的積累動(dòng)態(tài)，探明從培養(yǎng)的愈傷組織提取黃酮的最佳時(shí)段。通過優(yōu)化提取工藝和篩選最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度與配比，運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)提高了羅布麻愈傷組織中黃酮含量。

羅布麻;黃酮;愈傷組織;提取工藝;植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

羅布麻(Apocynum venetum L.)別名野麻、澤漆麻、茶葉花等［1］，屬夾竹桃科多年生直立草本植物［2］，分布于我國(guó)新疆、青海、甘肅、河北等西北鹽堿和沙漠地區(qū)［3］，在新疆的阿克蘇地區(qū)、塔里木河、孔雀河畔和羅布泊的資源較豐富［4］，但近年野生面積迅速在縮減。羅布麻是一種名貴的中草藥，收載于1977年、1985年、1990年和2005年的《中華人民共和國(guó)藥典》之中［5，6］?，F(xiàn)代研究表明，羅布麻的主要活性成分為黃酮類化合物［7］，其藥用和保健功效與其富含的黃酮類成分密切相關(guān)，羅布麻葉中主要含有金絲桃苷、異槲皮素、槲皮素-3-O-槐糖苷、蕓香苷、槲皮素等黃酮類成分［8］，具有降壓、降血脂、保肝和抗脂質(zhì)過氧化等作用［9］。因此，為了保護(hù)羅布麻野生資源，也為了探索應(yīng)用生物技術(shù)生產(chǎn)羅布麻有效成分，本文以羅布麻愈傷組織為材，采用響應(yīng)曲面優(yōu)化法優(yōu)化了總黃酮的提取工藝，比較了在不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度與配比誘導(dǎo)下生長(zhǎng)的愈傷組織中的黃酮含量，旨在探索通過羅布麻組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)高產(chǎn)量黃酮的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

羅布麻種子于2008年9月采自新疆精河縣火車站以西的沙質(zhì)戈壁。種子用0.1%升汞(加1～2滴吐溫-20)消毒1 min，再用無菌水漂洗4～6次。將滅菌的種子接種到未附加植物激素的MB培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)。種子發(fā)芽生長(zhǎng)約10 d，無菌條件下取下胚軸，切成0.6 cm左右長(zhǎng)，置于附加不同濃度與組合的2，4-D、6-BA、KT、NAA四種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(表6)的MB培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織的暗誘導(dǎo)并繼代培養(yǎng)三次(每次30 d)，培養(yǎng)基蔗糖濃度為30 g/L、瓊脂7 g/L、pH值為5.8。培養(yǎng)溫度為24±2℃，光照周期為12 h，繼代時(shí)光照強(qiáng)度為2500 μmol photos/m·s。將得到的愈傷組織在常溫下晾干，研成粉末，并過40目篩待測(cè)。

1.2 儀器與設(shè)備

水浴鍋;AL104電子天平(METTER TOLEDO); Spectrumlab 53紫外可見分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)等。

1.3 試劑

甲醇;乙醇;NaNO2;Al(NO3)3;NaOH(均為分析純);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)購(gòu)于西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取12.5 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，濃度為0.5 mg/mL(儲(chǔ)備液Ⅰ)。分別從儲(chǔ)備液Ⅰ中準(zhǔn)確吸取0、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL和5.0 mL于25 mL的容量瓶中，加水少許，再加5%的NaNO20.7 mL，搖勻，5 min后加10%Al(NO3)30.7 mL，搖勻，5 min后再加入1 mol/L NaOH 4 mL，加水至刻度，10 min后在510 nm處測(cè)定吸光值。以蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:y=10.46x-0.0002，R2=0.9996，蘆丁濃度在0～0.1 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

1.4.2 羅布麻愈傷組織中總黃酮的提取

根據(jù)表1設(shè)計(jì)的提取試劑、料液比、提取時(shí)間和提取溫度四個(gè)試驗(yàn)測(cè)定0.100 g愈傷組織粉末中黃酮含量，應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化總黃酮提取工藝。

分別準(zhǔn)確稱取各種處理的愈傷組織粉末0.100 g置于試管中，在最佳提取條件下用水提醇沉法提取愈傷組織中總黃酮，在提取時(shí)間到達(dá)一半時(shí)取出過濾，再加入同等劑量的溶劑繼續(xù)提取，最后過濾，合并濾液，容量瓶分別定容至10 mL。

1.4.3 總黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取上述濾液1.00 mL，加入到25 mL容量瓶中，按測(cè)黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法在510 nm處測(cè)定吸收值，測(cè)三次取平均值。將吸收值代入總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出羅布麻愈傷組織中含有的總黃酮量。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)曲面法對(duì)提取羅布麻愈傷組織中黃酮工藝的優(yōu)化

單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)按上述“1.4.2”項(xiàng)和“1.4.3”方法測(cè)定黃酮含量。試驗(yàn)材料為在MB+KT (0.2 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)并繼代的愈傷組織粉末。試驗(yàn)順序?yàn)樵谶M(jìn)行完試驗(yàn)一之后，確定最佳的提取試劑，再進(jìn)行試驗(yàn)二。在最佳試劑的條件下摸索最佳的料液比，再進(jìn)行試驗(yàn)三，得出最佳的提取時(shí)間，最后在前三個(gè)最佳的條件下進(jìn)行試驗(yàn)四得到最適的提取溫度。詳細(xì)的結(jié)果見圖1～5。

表1 試驗(yàn)步驟及結(jié)果Table 1 experimental process and results

四70%甲醇 1∶30 4 h 40、50、60、70、75、80℃ 最佳提取溫度為75℃

圖5 提取溫度對(duì)黃酮含量的影響Fig.5 Effects of temperature on flavonoids content

2.2 響應(yīng)曲面對(duì)總黃酮提取工藝的優(yōu)化

利用Minitab15軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以提取試劑(A)，物料比(B)，提取時(shí)間(C)及提取溫度(D)四個(gè)因子為自變量，以提取的總黃酮含量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)四因素三水平共28個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)因素的水平選取如下:

表2 響應(yīng)面分析因子及水平表Table 2 Factors and levels of RSM analysis

實(shí)驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，得到的響應(yīng)值平均后用Minitab15軟件進(jìn)行分析，并得出響應(yīng)面/等值線圖，方差分析表。響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3.

表3 實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 3 Design and results of tests

9 0 0 1 -1 44.50 10 0 1 1 0 50.48 11 1 -1 0 0 39.25 12 0 0 1 1 36.14 13 -1 -1 0 0 45.28 14 0 1 -1 0 46.44 15 0 0 -1 -1 42.59 16 0 -1 1 0 48.33 17 0 0 0 0 42.14 18 -1 0 -1 0 45.23 19 1 0 -1 0 45.47 20 0 1 0 1 35.90 21 0 -1 0 1 35.43 22 0 0 0 0 42.59 23 -1 1 0 0 46.18 24 0 -1 -1 0 46.18 25 0 0 0 0 43.00 26 0 1 0 -1 51.92 27 -1 0 1 0 48.80 28 1 0 0 1 35.74

表4 參數(shù)估計(jì)Table 4 Parameter estimates

表5 回歸分析結(jié)果Table 5 Results of regression analysis

由表4可以得出，對(duì)總黃酮含量影響的程度由大到小依次為提取溫度＞提取試劑＞物料比＞提取時(shí)間。其中提取溫度的影響最為顯著(P＜0.05)。由表5可以知道，失擬項(xiàng)P=0.057＞0.05，說明在P=0.05水平上不顯著，模型與實(shí)驗(yàn)值的差異性較小，模型擬合情況好。響應(yīng)曲面圖和等值線圖詳見附表圖6-圖11。由響應(yīng)曲面分析結(jié)果可以得出，用水提醇沉法提取總黃酮的最佳條件為提取試劑為70%甲醇，料液比1∶40，提取時(shí)間4 h，提取溫度為70℃。

2.3 黃酮在愈傷組織中的積累動(dòng)態(tài)

將無菌下胚軸在培養(yǎng)基MB+2，4-D(0.1 mg/ L)+6-BA(0.5 mg/L)上暗誘導(dǎo)并繼代，在第一次繼代培養(yǎng)時(shí)，每3 d收集愈傷組織，并測(cè)定其黃酮含量。30 d后統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，黃酮在羅布麻愈傷組織中的積累如圖12所示，黃酮含量在羅布麻愈傷組織中的積累基本呈‘S’型，前6 d黃酮含量增長(zhǎng)較緩，第7～12 d增長(zhǎng)很快，第15 d黃酮含量達(dá)到最大值，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮的含量逐漸降低。由此得出，從培養(yǎng)的羅布麻愈傷組織中生產(chǎn)黃酮的最佳時(shí)段為15 d.

圖12 黃酮含量在愈傷組織中的積累動(dòng)態(tài)Fig.12 The accumulatiive dynamic state of flavonoids content in callus

2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)羅布麻愈傷組織中總黃酮含量的影響

由表6可見，不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)愈傷組織中黃酮含量有顯著影響。在6-BA和2，4-D組合中，隨著6-BA和2，4-D的增高，黃酮含量也逐漸增加，當(dāng)2，4-D的濃度達(dá)到0.5 mg/L、6-BA為2.0 mg/L時(shí)，黃酮含量最大，達(dá)到52.63 mg/g;在6-BA和 NAA組合中，1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA誘導(dǎo)的愈傷組織中黃酮含量最高，達(dá)到56.93 mg/g。其中，黃酮含量最高的愈傷組織誘導(dǎo)條件為:MB+KT(1.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)，總黃酮的含量為73.90 mg/g。

表6 不同植物激素對(duì)黃酮含量的影響Table 6 The influence of flavonoids content with different growth regulor

4 0.1 2.0 0 0 17.97 5 0.5 1.0 0 0 21.80 6 0.5 1.5 0 0 28.49 7 0.5 2.0 0 0 52.63 8 1.0 3.0 0 0 19.41 9 2.0 5.0 0 0 11.52 10 0 0.3 0 0.1 50.48 11 0 0.5 0 0.1 52.39 12 0 1.0 0 0.1 39.96 13 0 1.5 0 0.1 38.05 14 0 2.0 0 0.1 50.24 15 0 1.0 0 0.5 56.93 16 0 1.5 0 0.5 48.81 17 0 2.0 0 0.5 56.45 18 0 0 0.2 0.2 51.91 19 0 0 0.5 0.2 65.30 20 0 0 1.0 0.2 73.90 21 0 0 2.0 0.2 67.21 22 0 0 3.0 0.2 61.23 23 0 0 4.0 0.2 42.83 24 0 0 5.0 0.2 62.19 25 0 0 0.5 0.5 40.93 26 0 0 1.0 1.0 67.69 27 0 0 2.0 2.0 53.59 28 0 0 3.0 3.0 64.58 29 0 0 4.0 4.0 42.83 30 0 0 5.0 5.0 37.81

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不僅是影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的主要因素，也是影響細(xì)胞次生代謝物積累的重要因素。據(jù)研究報(bào)道，生長(zhǎng)素類物質(zhì)如2，4-D和NAA可以誘導(dǎo)早S期細(xì)胞的端粒酶活性增強(qiáng)，有利于穩(wěn)定細(xì)胞的分裂能力，減緩細(xì)胞衰老［10］。培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素類調(diào)節(jié)劑如6-BA、KT，能增加愈傷組織中分生細(xì)胞數(shù)，有利于細(xì)胞數(shù)量和愈傷組織體積增加［10］。據(jù)姜玲等報(bào)道，以銀杏幼葉誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，KT與NAA組合，NAA與6-BA組合均能使細(xì)胞干重和黃酮糖苷含量同時(shí)提高［11］。本文研究結(jié)果表明，將KT和NAA配合使用，既有利于細(xì)胞增殖，也有利于次生代謝物的積累，印證了姜玲等人的結(jié)果。本文通過優(yōu)化從羅布麻愈傷組織提取總黃酮的工藝和篩選最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度與配比，為利用組織培養(yǎng)技術(shù)提高羅布麻愈傷組織中總黃酮含量奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of Extraction Process and Plant Growth Regulators on Flavonoids Content in Callus of Apocynum venetum

LIU Xiao-rui，JI Qiao-ling*，MIAO Shu-kui，XING Si-lei
College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China

Optimization of flavonoids extraction process carried out in callus of Apocynum venetum through the response surface method after single factor was studied.The method indicated that there were significant effects to flavonoids content in extracting reagent and temperature.The optimal parameter for extracting flavonoids were conformed by analysis of response surface method as follows:the extracting reagent is 70%methanol，the ratio of solid to liquid is 1∶40，the extracting time was 4 h，the extracting temperature is 70℃.Flavonoids were measured respectively from the callus induced for 100 d on 30 kinds of different concentration and combination of plant growth regulators.The results showed that the best culture medium was MB+KT(1.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)，flavonoids contain in callus on the medium for 100 d reached 73.90 mg/g.accumulative dynamic state of flavonoids in callus cultured for 30 d were measured continuously，the optimal time of extracting flavonoids was determined.Flavonoids content in callus of A.venetum were increased with tissue culture technology through optimizing extraction process and screening concentration and combination of plant growth regulators.

Apocynum venetum L.;flavonoids;callus;extraction process;plant growth regulator

1001-6880(2011)05-0882-07

2009-12-28 接受日期:2010-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(亞麻與羅布麻體細(xì)胞雜交及其種質(zhì)的耐鹽性遺傳研究30660095);新疆教育廳重點(diǎn)科研項(xiàng)目(亞麻與羅布麻體細(xì)胞雜交育種研究XJEDU2006108)

*通訊作者 Tel:86-013669900154;E-mail:wji1118@yahoo.com.cn

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