杜秀菊，張秀省，張勁松，賈 薇，劉艷芳，楊 焱，唐慶九，周 帥

1聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，聊城252059;2國家食用菌工程技術(shù)研究中心國家食用菌加工技術(shù)分中心上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201106;3聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城252059

北蟲草體外抗氧化和PC12氧化損傷修復(fù)作用的有效部位的篩選

杜秀菊1，2，張秀省3，張勁松2*，賈 薇2，劉艷芳2，楊 焱2，唐慶九2，周 帥2

1聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，聊城252059;2國家食用菌工程技術(shù)研究中心國家食用菌加工技術(shù)分中心上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201106;3聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城252059

采用系統(tǒng)溶劑法對北蟲草子實(shí)體進(jìn)行依次提取，制備得氯仿相、乙酸乙酯相和乙醇相三部位，利用化學(xué)發(fā)光法和H2O2誘導(dǎo)PC12氧化損傷修復(fù)模型，對三部位進(jìn)行體外抗氧化活性和PC12氧化損傷修復(fù)作用測定。結(jié)果表明，乙酸乙酯相具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是清除H2O2自由基和超氧自由基活性最強(qiáng)的部位，IC50值分別為88.5 μg/mL和190 μg/mL;乙酸乙酯相對由H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用較強(qiáng)，且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。無論從抗氧化活性，還是從對H2O2氧化損傷的修復(fù)作用，乙酸乙酯相均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的作用，乙酸乙酯相是抗氧化活性和保護(hù)PC12細(xì)胞氧化損傷的主要有效部位。

北蟲草;抗氧化;PC12細(xì)胞;氧化損傷;系統(tǒng)溶劑法

傳統(tǒng)野生的冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)的生長不僅需要特殊的生境，還具有嚴(yán)格的寄生性，所以自然資源極度匱乏，被列為一級保護(hù)物種，價格堪比黃金，無法滿足社會需求。和C.sinensis同屬異種的北蟲草(C.militaris)，是蟲草屬的模式種，又稱北冬蟲夏草，蛹蟲草等，是寄生在鱗翅目和鞘翅目等昆蟲蛹體上的真菌，研究表明，兩者的化學(xué)成分、營養(yǎng)成分和藥理功能均非常相似，因而可以作為冬蟲夏草的最佳替代品［1］。研究表明，北蟲草具有抗腫瘤［2］、增強(qiáng)免疫功能［3］、抗氧化［4］、抗疲勞［3］、抗菌抗病毒［5］等多種生理功能，開發(fā)北蟲草及其活性成分具有很高的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益，已引起諸多國內(nèi)外同行的廣泛關(guān)注。

本研究利用化學(xué)發(fā)光法和H2O2誘導(dǎo)的PC12氧化損傷修復(fù)模型，對系統(tǒng)溶劑法提取制備得到的氯仿相、乙酸乙酯相、乙醇相等三個部位進(jìn)行了抗氧化活性和氧化損傷修復(fù)活性的系統(tǒng)篩選，本試驗(yàn)結(jié)果將對科學(xué)開發(fā)利用北蟲草資源奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和試劑

北蟲草子實(shí)體，由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所提供。

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、DMSO (二甲亞砜)購自GIBCO公司;魯米諾、鄰苯三酚和NGF購自Sigma公司;鏈霉素、青霉素購自Amersco公司;Alamar Blue購自Biosource公司;其它均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 北蟲草子實(shí)體的提取

稱取北蟲草子實(shí)體干品100 g，粉碎機(jī)粉碎，60目過篩，氯仿68℃回流2 h，收集上清濃縮干燥得氯仿相(CHCl3相，命名為CMCl);沉淀揮干氯仿后，加乙酸乙酯78℃回流2 h，上清濃縮干燥得乙酸乙酯相(EtOAc相，命名為CMEtOAc);沉淀揮干乙酸乙酯后，加95%的食用酒精90℃回流2 h，上清濃縮干燥得乙醇相(EtOH相，命名為CMEtOH)。

2.2 抗氧化試驗(yàn)

2.2.1 樣品制備

精確稱取5 mg樣品，置于滅過菌的eppendorf管中，用1mL PBS緩沖液使之充分溶解。10000 r/ min離心30 min，無菌條件下收集上清，再將樣品分別稀釋成濃度分別為10、20、40、60、80、100、1.0 mg/ mL和2.0 mg/mL等備用。

2.2.2 超氧陰離子(O-·2)清除試驗(yàn)［6］

先于96孔板注入2 μL不同濃度的樣品溶液［空白對照和陽性對照分別以等量 0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液和超氧化物歧化酶(SOD)］，然后加入8 μL 6.25×10-4mol/L鄰苯三酚，由外部泵入150 μL魯米諾和碳酸鈉緩沖液混合液，每孔每0.6 s收集一次光信號，連續(xù)收集30 s，記錄相對發(fā)光強(qiáng)度。每個樣品設(shè)3次重復(fù)。超氧自由基清除率按下面的公式計(jì)算。

A0為空白的發(fā)光峰值，A1為加入樣品反應(yīng)后的發(fā)光峰值。

2.2.3 過氧化氫(H2O2)清除試驗(yàn)［6］

用Clarity化學(xué)發(fā)光儀(BIO-TEK公司)進(jìn)行測定。96孔板中每孔先注入10 μL H2O2溶液，再注入40 μL不同濃度的樣品溶液［空白對照和陽性對照分別以等量K2HPO4-KH2PO4緩沖液和Vc(Vitamin C)代替樣品］，再注入150 μL魯米諾和碳酸鈉緩沖溶液混合液。每孔每0.6 s收集一次光信號，連續(xù)收集30 s，記錄相對發(fā)光強(qiáng)度。每個樣品設(shè)3次重復(fù)。H2O2自由基清除率計(jì)算公式同超氧自由基清除率計(jì)算公式。

2.3 對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)試驗(yàn)［6］

2.3.1 樣品制備

精確稱取1 mg樣品，充分溶解于1mL DMSO緩沖液中。10000 r/min離心30 min，無菌條件下收集上清，再用DMSO分別將樣品稀釋成10、50 μg/mL和200 μg/mL備用。

2.3.2 DMEM培養(yǎng)液的配制

在高糖DMEM培養(yǎng)基中加入15%胎牛血清、2.5%馬血清、1×10 U/L青霉素和1×10 U/L鏈霉素，搖勻后備用。

2.3.3 氧化損傷修復(fù)試驗(yàn)

PC12細(xì)胞(由中國科學(xué)院上海藥物研究所丁侃研究員惠贈)接種于DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取出，離心(1000 r/min，3 min)，底部細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋為2× 104 cell/mL，于96孔板中每孔接種190 μL，加入10 μL H2O2處理液(陰性對照不加)，處理4 h后，吸去96孔板中所有培養(yǎng)基，每孔加入 199 μL新鮮DMEM培養(yǎng)液，然后每孔加入待測樣品。試驗(yàn)分為四組，具體方案如下:

(1)樣品組:199 μL DEME+PC12細(xì)胞 +1 μL樣品(經(jīng)H2O2處理);

(2)陰性對照組:199 μL DEME+PC12細(xì)胞+1 μL DMSO(未經(jīng)H2O2處理);

(3)陽性對照組:199 μL DEME+PC12細(xì)胞+1 μL NGF(經(jīng)H2O2處理)，NGF濃度為100 μg/mL;

(4)損傷對照(H2O2作用組M):199μL DEME +PC12細(xì)胞+1μL DMSO(經(jīng)H2O2處理)。

加好樣品的96孔板繼續(xù)放入37℃，含5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)，并用AlamarBlue Assay檢測細(xì)胞存活率［12］。該試驗(yàn)重復(fù)三次，只采用H2O2作用組損傷程度在40%～60%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。存活率根據(jù)如下公式計(jì)算:

存活率(%)=［117216×Aλ570(sample)-80856 ×Aλ600(sample)］/［117216×Aλ570(control)-80856 ×Aλ600(control)］×100%

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用STST統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析，n=3。

3 結(jié)果與分析

3.1 北蟲草子實(shí)體各部位的提取得率

北蟲草子實(shí)體三部位提取物經(jīng)干燥至恒重后稱重，計(jì)算后得知:CMCl、CMEtOA和CMEtOH的得率分別為0.83%、1.19%和4.22%，結(jié)果表明，EtOH相得率最高，EtOA相次之，CHCl3相最低。

3.2 子實(shí)體不同提取部位的抗氧化活性

北蟲草子實(shí)體不同提取部位對O-·2的清除結(jié)果如圖2所示。圖2表明，北蟲草子實(shí)體的三個部位對超氧自由基都有清除能力，其中CMEtOA的清除能力較強(qiáng)，CMEtOH次之，CMCl較差。

表1列出了北蟲草子實(shí)體不同提取部位的抗氧化活性的IC50值。由表1可以看出:CMEtOA、CME-tOH和CMCl的IC50分別為190、258 μg/mL和3.88 ×103μg/mL，表明CMEtOA和CMEtOH對超氧自由基都有較高的清除能力，CMEtOA的清除活性略高于CMEtOH，CMCl清除超氧自由基的能力最差，與CMEtOA相比較，呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)。

圖1 北蟲草子實(shí)體不同提取物對超氧自由基的清除率Fig.1 The scavenging rate of Oof the three extracts from C.militaris fruiting bodies

北蟲草子實(shí)體三部位對H2O2自由基的清除結(jié)果如圖3和表1所示。圖3表明，三部位對H2O2自由基都有清除能力，其中CMEtOA較強(qiáng)，CMCl次之，CMEtOH較差。它們的IC50值(見表1)表明: CMEtOA的最低，為88.5 μg/mL，其次為CMCl(227 μg/mL)，CMEtOH的最高(544.7 μg/mL)。因此，清除H2O2自由基的活性為:CMEtOA＞CMCl＞CMEtOH，三者清除H2O2自由基的活性呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)。

圖2 北蟲草子實(shí)體不同提取物對H2O2自由基的清除率Fig.2 The scavenging rate of H2O2of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

表1 北蟲草子實(shí)體不同提取物對超氧自由基和H2O2自由基的清除效果(IC50值)Table 1 Antioxidant effect(IC50)of Oand H2O2of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

表1 北蟲草子實(shí)體不同提取物對超氧自由基和H2O2自由基的清除效果(IC50值)Table 1 Antioxidant effect(IC50)of Oand H2O2of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

1Vc在清除H2O2試驗(yàn)中用于陽性對照;2SOD(超氧化物歧化酶)在清除超氧陰離子試驗(yàn)中用于陽性對照。1Vc(Vitamin C)was used as positive control in H2assay;2SOD(Superoxide Dismutase)was used as positive control in Oassay.

IC50(μg/mL)樣品Sample 227 CMEtOA 190 88.5 CMEtOH 258 544.7維生素C(Vc)1 - 22.3超氧化物歧化酶(SOD)2 3.7×10-2 assay CMCl 3.88×103 O-· 2 assay H2O2 -

3.3 北蟲草子實(shí)體不同提取物對 H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用

北蟲草不同部位的提取物對PC12細(xì)胞的氧化損傷的修復(fù)作用結(jié)果見表2。PC12細(xì)胞經(jīng)過氧化劑H2O2處理后，H2O2作用組的細(xì)胞存活率下降到了(43.56±2.5)%，陽性對照NGF在0.1 μg/mL時的修復(fù)率為(98.03±1.3)%，陽性對照NGF和樣品組的細(xì)胞存活率均高于H2O2作用組的細(xì)胞存活率，表明了樣品對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷都有不同程度的修復(fù)作用。CMEtOA和CMCl呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)正相關(guān)，表明對H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的修復(fù)作用隨著濃度升高而增強(qiáng);CMEtOH當(dāng)濃度為10 μg/mL增至50 μg/mL時，PC12細(xì)胞的存活率由(61.98±0.8)%上升到(65.44±2.1)%，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)正相關(guān)，但當(dāng)濃度增至200 μg/mL時，細(xì)胞存活率反而下降到了(58.76±1.7)%，表明CMEtOH組分內(nèi)有可能含有抑制氧化損傷修復(fù)作用的組分，需要對其進(jìn)一步分離純化研究后確定。三部位相比較，CMEtOA的細(xì)胞存活率最高，在10 μg/mL、50 μg/mL和200 μg/mL時的細(xì)胞存活率分別為(70.02±1.2)%、(80.57±2.5)%和(85.37± 3.0)%，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。在200 μg/mL時，CMEtOA的細(xì)胞存活率與CMCl相當(dāng)，二者與CMEtOH相比，呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)。綜上所述，CMEtOA對由H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有明顯的修復(fù)作用，CMCl稍次之，CMEtOH最差。

表2 北蟲草不同提取物對PC12細(xì)胞的氧化損傷修復(fù)作用Table 2 Rehabilitation effect of PC12 cell of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

4 討論與結(jié)論

4.1 食、藥用真菌是產(chǎn)生天然活性化合物的天然寶庫。天然的抗氧化劑是一類重要的生物活性物質(zhì)，可以清除人體代謝過程中產(chǎn)生的自由基，具有延緩機(jī)體衰老之功效。不但可以作為食品添加劑，也可以用于化妝品行業(yè)，無論在國內(nèi)還是在國外受到越來越多的青睞。本研究利用化學(xué)發(fā)光法，對北蟲草子實(shí)體的三個不同提取部位進(jìn)行了抗氧化活性的篩選，試驗(yàn)結(jié)果表明，三個部位(CHCl3相、EtOAc相和EtOH相)均有抗氧化活性，其中EtOAc相是清除H2O2自由基的最主要的活性部位(IC50值為88.5 μg/mL)，也是清除超氧自由基的最主要的活性部位(IC50值為190 μg/mL)，在同一試驗(yàn)濃度下，EtOAc相對H2O2自由基的清除率高于對超氧自由基的清除率。EtOAc相抗氧化的有效成分還有待于進(jìn)一步分離純化后確定。

4.2 據(jù)報(bào)道［7］，本研究用作陽性對照的神經(jīng)生長類物質(zhì)(NGF，神經(jīng)生長因子)對損傷神經(jīng)具有較強(qiáng)的修復(fù)作用，但這類營養(yǎng)因子往往取自動物機(jī)體，數(shù)量極少所以價格昂貴。目前已發(fā)現(xiàn)猴頭［8］、雞樅［9］和靈芝［10］等食藥用菌中，均含有神經(jīng)營養(yǎng)成分的有效成分。北蟲草子實(shí)體對神經(jīng)保護(hù)作用的研究較少有報(bào)道。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室成功建立的體外模擬自由基損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的模型，以北蟲草子實(shí)體不同部位的提取物為研究材料，評價了受試樣品對H2O2誘導(dǎo)的PC12氧化損傷修復(fù)作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，EtOAc相能明顯促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)損傷后的PC12增殖，且呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，200 μg/mL時的細(xì)胞存活率為(85.37±3.0)%，明顯高于H2O2作用組，且與EtOH相比呈現(xiàn)極顯著差異(P＜0.01)，因此，EtOAc相對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的氧化損傷具有明顯的修復(fù)作用，是具有氧化損傷修復(fù)作用的有效部位。

4.3 綜上所述，無論是從抗氧化活性，還是從氧化損傷修復(fù)活性的角度，EtOAc相均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的作用。龐小博［7］(2009)提到氧化損傷修復(fù)的有效成分不一定是抗氧化物質(zhì)，本研究試驗(yàn)結(jié)果表明，北蟲草的抗氧化活性部位和氧化修復(fù)活性部位均為EtOAc相，二者達(dá)到了統(tǒng)一，當(dāng)然它們的有效成分未必是同一種物質(zhì)，因?yàn)楸驹囼?yàn)中，EtOAc相是指溶解于乙酸乙酯的所有物質(zhì)的混合物。所以接下來的工作重點(diǎn)將是:以生物活性作為跟蹤指標(biāo)對其進(jìn)一步分離純化，以期得到活性最強(qiáng)的有效成分的單體。

至于EtOAc相中的有效成分究竟通過何種途徑促進(jìn)氧化損傷的PC12神經(jīng)細(xì)胞的增殖作用，亦將有必要做進(jìn)一步的探討。

1 Chen LT(陳俐彤)，Cao HF(曹紅峰)，Huang WF(黃文芳).Chemical composition，pharmic effect and application of Cordyceps militaris.Modern Food Sci Technol(現(xiàn)代食品科技)，2005，21:192-197.

2 Sun KF(孫科峰)，Shi W(石偉)，Liu L(劉麗)，et al.Experimental Studies on antitumor of Cordyceps militaris fruiting bodies.Liaoning J Tradit Chin Med(遼寧中醫(yī)雜志)，2004，31:520-521.

3 Ji LN(季麗娜)，Chen BC(陳葆春)，Liu HD(劉洪德)，et al.Experimental studies on effect of immunostimulation，blood-fat regulation，antifatigue and nutrition of Cordyceps militaris.Pract Prev Med(實(shí)用防預(yù)醫(yī)學(xué))，2002:178-179.

4 Shen QY(沈齊英)，Shen QY(沈秋英).Study on the resisting oxygen free radical and hydroxyl free radical effect of Cordyceps militaris.Guidaia(廣西植物)，2001，21:252-254.

5 Li Z(李祝)，Liu AY(劉愛英)，Liang ZQ(梁宗琦).Biological activity and determination method of Cordycepin.Acta Edulis Fungi(食用菌學(xué)報(bào))，2002，9:57-62.

6 Du XJ(杜秀菊)，Zhang JS(張勁松)，Liu YF(劉艷芳)，et al.The antioxidant activity of various extracts from Tremella aurantialba fruiting bodies and their protective effects on PC12 cells injured by oxidation.Acta Agric Shanghai(上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2010，26(2):49-52.

7 Pang XB(龐小博)，Zhang JS(張勁松)，Tang QJ(唐慶久)，et al.Protective effects of lipophilic extracts of medicinal fungi against oxidative-stress damage in PC12 cells.Acta Agric Shanghai(上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2009，25:9-13.

8 Kawagishi H，Ando M，Sakamoto H，et al.Hericenones C，D and E，Stimulator of nerve growth factor(NGF)-synthesis，from the mushroom Hericium erinaceum.Tetrahedron Lett，1991，32:4561-4564.

9 Qi J H，Ojika M，Sakagami Y.Termitomycesphins A-D，Novel Neuritogenic Cerebrosides from the Edible Chinese Mushroom Termitomyces albuminosus.Tetrahedron Lett，2006，56: 5835-5841.

10 Zhang L(張麗)，Peng SP(彭少平)，Han R(韓蓉)，et al.A lipophilic fraction of Ganoderma lucidum promotes PC12 differentiation.Chin Pharmacol Bull(中國藥理學(xué)通報(bào))，2005，21:662-667.

Antioxidant Activity and Oxidative Injury Protection for PC12 of Three Extracts from Cordyceps militaris Fruiting Bodies in vitro

DU Xiu-ju1，2，ZHANG Xiu-sheng3，ZHANG Jing-song2*，JIA Wei2，LIU Yan-fang2，
YANG Yan2，TANG Qing-jiu2，ZHOU Shuai21College of Life Science，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China;2National Engineering Research Center of Edible Fungi;National R＆D center for edible fungi processing;Edible Fungi Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China;3College of Agricultural Science，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China

Cordyceps militaris fruiting bodies were extracted by using the method of systematic solvent extraction，and three different extracts were prepared named chloroform extract，acetic ether extract and ethanol extract，respectively.In vitro，the antioxidant activities of different extracts were investigated by using chemiluminescence measurements，and the activities of oxidative injury protection were assessed by using PC12 oxidative injury model induced with H2O2.The superoxide free radical(O－·2)system and H2O2system assays showed that the acetic ether extract had notable antioxidant activity，their scavenging rate for both H2O2and O－·2were highest among the three extracts，whose IC50were 88.5 μg/ mL and 190 μg/mL，respectively.Moreover，the oxidative injury protection for PC12 assay showed that the acetic ether extract had significant rehabilitation effect in comparison with chloroform extract and ethanol extract，and it rehabilitated PC12 cell treated with H2O2in a dose-dependent manner.Therefore，it was concluded that the acetic ether extract was the principal extract of both antioxidant and the activity of oxidative injury rehabilitation among three extracts from C.militaris fruiting bodies.

Cordyceps militaris;antioxidant activity;PC12 cell;oxidative injury;systematic solvent extraction

1001-6880(2011)05-0905-05

2010-12-29 接受日期:2011-05-11

國家科技部支撐基金項(xiàng)目(2006BAD06B08)

*通訊作者 E-mail:zhangjs8888@yahoo.com.cn

R284.2

A