范 文 阮長青 王鶴霖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319)

DA201－C大孔吸附樹脂對腐乳多肽脫鹽作用的研究

范 文 阮長青 王鶴霖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319)

為去除腐乳中的鹽分，利于其中活性肽的分離純化，以腐乳多肽的回收率為指標(biāo)，采用DA201－C大孔吸附樹脂對超濾的水溶性低聚肽的脫鹽工藝進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:DA201－C大孔吸附樹脂對腐乳多肽較佳的脫鹽工藝條件為上樣濃度45 mg/mL、洗脫流速120 mL/h、解吸劑為70%乙醇。腐乳多肽經(jīng)DA201－C大孔吸附樹脂處理后脫鹽率達(dá)到98.19%，肽回收率大于90%，抗氧化活性得到提高。利用DA201－C大孔吸附樹脂是進(jìn)行腐乳多肽脫鹽處理的一種簡便有效方法。

大孔吸附樹脂 腐乳多肽 脫鹽

腐乳是中國傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵制品，腐乳中的蛋白質(zhì)主要以多肽的形式存在。與大豆蛋白相比，大豆多肽具有良好的物理性質(zhì)和生理功能［1］。其中的低分子多肽已被逐步證明其在營養(yǎng)學(xué)方面優(yōu)于蛋白質(zhì)和游離的氨基酸。大豆多肽含有被激活的組氨酸、酪氨酸和其它活性物質(zhì)，可改善人體消化、吸收功能，并能有效地捕捉人體內(nèi)的自由基、甲氧基、氧化物等［2］，并能螯合重金屬離子。倪莉等［3］采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)和高效液相色譜(HPLC)法對腐乳中的大豆蛋白酶解物進(jìn)行分析，用改進(jìn)的HPLC法對腐乳中多肽進(jìn)行測定，結(jié)果顯示腐乳中的含氮物質(zhì)主要是分子質(zhì)量小于10 000 u的肽和氨基酸。程麗娟等［4］研究發(fā)現(xiàn)腐乳中大豆蛋白經(jīng)微生物作用后，中分子和低分子蛋白含量增多，這部分蛋白的分子質(zhì)量一般較小，易于人體的吸收利用，也是生理活性最強(qiáng)的部分。目前，隨著人們對大豆活性成分研究不斷的深入，腐乳中的活性物質(zhì)引起了人們的關(guān)注。

利用水法提取腐乳多肽時腐乳的鹽類溶于提取物中，對腐乳多肽的純度及活性產(chǎn)生影響，因此需要進(jìn)行脫鹽實(shí)驗(yàn)。目前生物活性物質(zhì)的脫鹽方法主要有透析、超濾和納濾等，但是這些方法對小分子物質(zhì)脫鹽效果不佳或無法實(shí)現(xiàn)，盡管電滲析可以用于小分子物質(zhì)的脫鹽，但是回收率不高、能源消耗大［5］。大孔吸附樹脂為非離子的高分子吸附劑，由苯乙烯、二乙烯苯、二甲丙烯酸酯等聚合而成網(wǎng)狀孔穴結(jié)構(gòu)，可根據(jù)分離物分子質(zhì)量大小及極性不同進(jìn)行分離，同時具有吸附、篩選的功能，其吸附特性與天然吸附劑特性相同。用于脫鹽具有選擇性好、吸附容量大、回收率高、再生處理方便、吸附迅速以及解吸容易、對原料生理生化性質(zhì)影響小等特點(diǎn)［6－8］。宮霞［9］研究發(fā)現(xiàn)，DA201－C大孔吸附樹脂對酪蛋白酶解液的脫鹽效果最佳，陳季旺等［10］研究了利用DA201－C大孔吸附樹脂對魚降壓肽的脫鹽作用。

試驗(yàn)主要通過研究DA201－C大孔吸附樹脂對腐乳多肽脫鹽的效果影響，確定腐乳多肽的最佳脫鹽工藝條件，為腐乳多肽的后續(xù)分離純化、活性測定以及工業(yè)化生產(chǎn)較高高活性成分的腐乳提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

腐乳:黑龍江省克東腐乳有限公司;DA201－C大孔吸附樹脂:江西市有機(jī)化工廠。

1.2 儀器

超濾膜包(10 000 u，3 000 u):德國Sartorius Stedim公司;BT600－2J蠕動泵:保定蘭格恒流泵有限公司;11－2B型高速組織搗碎機(jī):上海標(biāo)本模型廠;JJ－1電動攪拌器:江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;SG3電導(dǎo)率儀:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;玻璃層析柱(2.6 cm×30 cm)、HL－2D定時數(shù)顯恒流泵、HD－9707電腦紫外檢測儀器:上海精科實(shí)驗(yàn)有限公司;DBS－100電腦全自動部分收集器:上海滬西分析儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 腐乳多肽制備工藝

取體積較完整的腐乳，用水沖洗腐乳表面紅曲，瀝干、稱重，利用組織搗碎機(jī)混勻，獲得膏狀樣品。按1∶2.7比例加入蒸餾水，在40℃用電動攪拌器攪拌2.4 h，12 000 r/min離心，取上清液利用10 000 u超濾膜在40℃，壓力0.2 MPa超濾1.5 h。將獲得的超濾液再通過3 000 u超濾膜超濾，最終獲得腐乳多肽超濾液［11］。

1.3.2 大孔樹脂的預(yù)處理

將樹脂用無水乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，然后用無水乙醇洗至220 nm無吸收峰，再用去離子水洗凈備用。然后用5%HCl溶液洗滌，再用去離子水洗至中性，最后用2%NaOH溶液洗滌，再用去離子水洗至中性備用［12］。

1.3.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附能力的測定

在250 mL具塞錐形瓶中加入25 mL處理好的樹脂，向其中加入濃度為45 mg/mL的腐乳粗肽溶液20 mL，用塞子塞好，將錐形瓶放入25℃恒溫?fù)u床中160 r/min振蕩12 h，至吸附平衡，每隔0.5 h取樣進(jìn)行分析，測定溶液中多肽的濃度，并按下式計(jì)算吸附率和吸附量。

吸附量/mg/mL=(原液肽濃度－吸附后液體肽濃度)×溶液體積/濕樹脂體積

1.3.4 大孔樹脂對多肽的動態(tài)吸附及解吸

將DA201－C大孔吸附樹脂裝入2.6 cm×30 cm的層析柱，距柱口5 cm即可。在室溫條件下一定濃度的粗肽溶液上柱，用紫外檢測器檢測流出液的A220nm。先用去離子水洗滌層析柱，每8 mL洗脫液收集一管，每管取1 mL稀釋50倍，測定其電導(dǎo)率，當(dāng)電導(dǎo)率的值保持不變時，換成70%濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰，冷凍干燥。

1.3.5 最佳樣品濃度的確定

將腐乳粗肽溶液分別配置成 25、45、65、85 mg·mL－1上樣，去離子水洗滌層析柱，當(dāng)電導(dǎo)率值保持不變時，然后換成70%乙醇，固定流速為120 mL/h進(jìn)行洗脫。以多肽的回收率確定最佳樣品濃度。按下式計(jì)算多肽回收率。

1.3.6 最佳流速的確定

固定最佳腐乳多肽濃度進(jìn)行上樣，去離子水洗滌層析柱，當(dāng)電導(dǎo)率值保持不變時，然后換成70%乙醇進(jìn)行洗脫。分別將乙醇流速調(diào)成 60、90和120 mL/h洗脫大孔樹脂柱，以多肽的回收率確定最佳流速。

1.3.7 原料成分與活性分析

1.3.7.1 抗氧化活性的測定

采用南京建成生物工程研究所的抗超氧陰離子自由基和羥自由基測試盒進(jìn)行測定。

1.3.7.2 肽含量的測定

取2.5 mL樣品溶液，加入2.5 mL 10%的三氟乙酸水溶液與之混合，靜置10 min，在4 000 r/min下離心15 min然后用雙縮脲法測定［13］。

1.3.7.3 灰分含量的測定

馬弗爐灰化法(GB/T 5009.4—2003)［14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂對腐乳多肽靜態(tài)吸附能力

DA201－C大孔吸附樹脂對腐乳多肽的靜態(tài)吸附率和吸附量隨時間變化曲線見圖1。

圖1 大孔樹脂對腐乳多肽的吸附曲線

由圖1可以看出，在靜態(tài)吸附過程中，最初的3 h內(nèi)吸附率迅速增加，而3 h后，吸附率增加緩慢。達(dá)到吸附平衡后，吸附率為95.10%，吸附量為7.61 mg/mL。說明DA201－C大孔吸附樹脂對腐乳多肽吸附性能較好。DA201－C樹脂是非極性樹脂，是由偶極距很小的單體聚合制得，不帶任何功能基，孔表的疏水性較強(qiáng)，可通過與多肽內(nèi)的疏水部分的作用吸附溶液中的有機(jī)物。

2.2 大孔吸附樹脂對腐乳多肽動態(tài)吸附和解吸能力

DA201－C大孔吸附樹脂對腐乳多肽動態(tài)吸附的電導(dǎo)率和肽含量隨洗脫體積的變化曲線見圖2，動態(tài)解吸肽含量隨洗脫體積的變化曲線見圖3。

由圖2可知，電導(dǎo)率在洗脫體積48 mL時達(dá)到最大值11.21 ms/cm，在洗脫體積達(dá)到400 mL時電導(dǎo)率趨于平穩(wěn)，此時多肽溶液中的鹽成分已幾乎被洗脫出來。未被吸附的肽含量很少。然后用70%乙醇對腐乳多肽進(jìn)行動態(tài)解吸。用乙醇對大孔吸附樹脂進(jìn)行洗脫實(shí)質(zhì)上是一種由疏水性質(zhì)決定的置換過程，乙醇能削弱蛋白質(zhì)非極性側(cè)鏈的排水傾向［15］，從而將疏水性肽從樹脂上洗脫下來。由圖3可知大部分多肽集中在50～160 mL洗脫體積處洗脫下來。

2.3 最佳樣品濃度的確定

腐乳多肽進(jìn)樣量為40 mL，超濾液濃度為25、45、65、85 mg/mL，乙醇流速120 mL/h洗脫時，多肽回收率與樣品濃度之間的關(guān)系見圖4。

圖4 樣品濃度對腐乳多肽回收率的影響

結(jié)果顯示，隨著質(zhì)量濃度的增加，多肽回收率逐漸變小，這是因?yàn)闃悠窛舛刃r，能與樹脂充分接觸，在疏水相互作用下，能有效被樹脂吸附。與濃度大的樣品相比，損失率較低，回收率較高。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，多肽回收率為95.28%，考慮到樣品濃度與利用樹脂吸附的因素，選擇45 mg/mL為最佳質(zhì)量濃度，多肽回收率為90.32%。

2.4 最佳流速的確定

腐乳多肽進(jìn)樣量為40 mL，超濾液濃度為45 mg/mL，乙醇流速分別為60、90和120 mL/h洗脫時，多肽回收率與洗脫劑流速之間的關(guān)系見圖5。

圖5 流速對腐乳多肽回收率的影響

結(jié)果顯示，洗脫劑乙醇流速從60 mL/h增加到120 mL/h時，多肽回收率降低。流速主要影響溶質(zhì)向樹脂表面擴(kuò)散，隨著流速的增加，洗脫劑與樹脂接觸時間變短，多肽不能被完全置換下來。但是120 mL/h和60 mL/h相比，多肽回收率下降不明顯，考慮到生產(chǎn)周期問題，最佳流速確定為120 mL/h。

2.5 脫鹽效果分析

根據(jù)上述結(jié)果，確定腐乳多肽脫鹽工藝的條件為多肽進(jìn)樣量40 mL、濃度為45 mg/mL，70%乙醇洗脫，流速為120 mL/h。在該工藝條件下對腐乳多肽進(jìn)行脫鹽，收集的洗脫液經(jīng)真空濃縮和冷凍干燥，其活性分析見表1。

表1 脫鹽前后腐乳多肽抗氧化活性比較

結(jié)果表明，脫鹽后灰分含量明顯降低，脫鹽率達(dá)到98.19%，抑制羥自由基能力和抗超氧陰離子能力分別從 5.54 U/mgprot和 31.51 U/gprot提 高 到6.26 U/mgprot和 33.37 U/gprot。說明鹽分對腐乳多肽的活性存在一定的影響，鹽含量高，影響多肽的活性成分。脫鹽后，腐乳多肽的抗氧化活性增強(qiáng)。

3 結(jié)論

DA201－C型大孔吸附樹脂對腐乳多肽較佳脫鹽工藝條件為上樣濃度45 mg/mL、洗脫劑為70%乙醇，流速120 mL/h。腐乳多肽經(jīng)DA201－C大孔吸附樹脂處理后脫鹽率達(dá)到 98.19%，回收率為90.32%，抗氧化活性得到提高，同時該過程還伴隨著明顯的純化作用。因此DA201－C大孔吸附樹脂綜合性能較好，是進(jìn)行腐乳多肽脫鹽處理的一種簡便有效方法，為腐乳多肽的進(jìn)一步的分離純化和活性研究奠定基礎(chǔ)。

［1］邵偉，熊澤，何曉文.發(fā)酵大豆多肽及其功能研究［J］.食品科技，2005(4):26－28

［2］Yu B，Lu Z X，Bie X M，et al.Scavenging and anti－ fatigue activity of fermented defatted soybean peptides［J］.European Food Research and Technology，2008，226:415 －421

［3］倪莉，饒平凡，王璋.腐乳中生理活性多肽的分離和表征［J］.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1997，23:93 －97

［4］程麗娟，趙樹欣，曹井國，等.對中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中各種含氮組分的分析［J］.中國釀造，2005，7:47 －49

［5］Tang Z G，Zhou R Q，Duan Z T.Adsorption and desorption behaviour of taurine on macroporous adsorption resins［J］.Journal of Chemical Technology and Biotechno1ogy，2001，76(7):752－756

［6］Mills G C.Removal of salts from aromatic amino acids，their metabolites and related compounds using an XAD－4 resin［J］.Journal of Chromatography A，1986，355:193 －200

［7］鄧勁光，胡熙恩，朱永.大孔吸附樹脂對氫化可的松的吸附與洗脫性能研究［J］.離子交換與吸附，2000，16(2):134－139

［8］Gokmen V，Serpen A.Equilibrium and kinetic studies on the adsorption of dark colored compounds from apple juice using adsorbent resin［J］.Journal of Food Engineering，2002，53(3):221－227

［9］宮霞，趙駿.大孔吸附樹脂對酪蛋白酶解液的脫鹽作用研究［J］.食品科學(xué)，2006，27(11):301 －303

［10］陳季旺，孫勤，夏文水.魚降壓肽的大孔吸附樹脂脫鹽及理化性質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2009，50(24):158－167

［11］王鶴霖，阮長青.克東腐乳中低聚肽的分離及其抗氧化活性研究［J］.中國糧油報，2010，25(9):23－26

［12］袁懷波，趙國華，李洪軍，等.利用大孔吸附樹脂純化葛根異黃酮的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29(2):62－65

［13］Levin R，Brauer R W.The biuret reaction for the determination of proteins:an in proved reagent and its application［J］.The Journal of laboratory and clinical medicine，1951，38(3):474－480

［14］衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所GB/T 5009.4—2003食品中灰分的測定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003

［15］Mishra A K，Ahluwalia J C.Alcohol induced conformational transitions of proteins and polypeptides［J］.International Journal of Peptide and Protein Research，1983，21(3):322 －330.

Study on Desalination of DA201－C Macroporous Adsorption Resin on Fermented Bean Curd Polypeptide

Fan Wen Ruan Changqing Wang Helin
(College of food science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319)

In order to remove the salt of fermented bean curd，benefit the separation and purification of active peptide and realize the target of the recovery rate of fermented bean curd polypeptides，the desalting technology of fermented bean curd polypeptides which were water－soluble after ultrafiltration by DA201－C macroporous adsorption resin was investigated.The results indicated that the optimum condition for desalting was obtained as follows:loading sample concentration of 45 mg/mL，flow speed of 120 mL/h and 70%alcohol as eluent.Under these conditions，the ratio of fermented bean curd polypeptides desalination reached to 98.19%，and the recovery of peptides was more than 90%.Moreover，its antioxidant activity was enhanced.In conclusion，the desalination method by using DA201 －C macroporous adsorption resin applied to fermented bean curd polypeptides was a simple and available method.

macroporous adsorption resin，fermented bean curd polypeptides，desalting

TS214.2

A

1003－0174(2011)08－0105－04

2010－09－21

范文，女，1986年出生，碩士，食品營養(yǎng)與安全

阮長青，男，1968年出生，教授，碩士生導(dǎo)師，食品營養(yǎng)與安全