吳峰華 羅自生 何志平 龐林江

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院1，杭州 310029)

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院2，臨安 311300)

山核桃外果皮總酚的微波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化研究

吳峰華1，2羅自生1何志平2龐林江2

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院1，杭州 310029)

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院2，臨安 311300)

在單因素試驗的基礎(chǔ)上以乙醇濃度、液料比和微波功率為試驗因素，以總酚得率為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗。并通過還原力、DPPH清除能力和β胡蘿卜素亞油酸三個體系來評價提取物的抗氧化能力。結(jié)果表明，山核桃外果皮中總酚提取的最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)56.0%，料液比1∶50，微波功率502.4 W提取時間100 s;實際測得總酚得率為123.41 mg/g，與模型預(yù)測值基本相符。山核桃外果皮提取物有很強的抗氧化活性，清除DPPH自由基的能力與BHT相當(dāng)。

山核桃外果皮 總酚 提取 響應(yīng)面 抗氧化

近年來天然抗氧化劑的研究備受關(guān)注，其中多酚類是主要的抗氧化活性成分之一。研究表明，酚類物質(zhì)能有效降低或者抑制由于氧化作用引起的心血管疾病、癌癥和衰老性疾病等多種慢性?。?－2］;同時對食品的保鮮也有積極的作用［3］。山核桃(Carya cathayensis)屬胡桃科山核桃屬木本植物，主要分布于浙、皖兩省交界的天目山區(qū)周圍，是浙江省乃至世界性特色干果。在利用完山核桃之后，外果皮基本屬于廢棄物，沒有得到充分利用，并且還造成了環(huán)境污染。通過對該屬植物果皮化學(xué)成分的研究，發(fā)現(xiàn)其含有黃酮類、萜類、萘醌及其苷、多酚、有機酸等多種成分［4］，具有開發(fā)成為植物源抗氧化劑、殺菌劑的潛力。目前對山核桃外果皮的研究主要集中在化學(xué)成分鑒定，提取物活體抑菌活性研究，黃酮提取條件的研究等方面，而對果皮總酚提取及其抗氧化研究鮮有報道［5－7］。采用微波輔助法提取山核桃外果皮中的總酚物質(zhì)，并通過響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝，同時通過還原力、DPPH清除能力和β-胡蘿卜素亞油酸3個體系評價提取物的抗氧化活性，以期為山核桃外果皮的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山核桃外果皮:9月上旬采自浙江臨安昌化山區(qū)。

福林酚試劑(Folin－Ciocalteus'reagent)、1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH)、β－胡蘿卜素:Sigma公司;其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 微波輔助提取工藝流程

山核桃外果皮原料→45℃恒溫干燥72 h→粉碎后過60目篩→山核桃外果皮粉末→加入一定量的乙醇溶液→微波輔助提取→抽濾→定容→總酚提取液

1.2.2 總酚含量測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對Lim等［8］報道的方法稍加改動:吸取質(zhì)量濃度分別為 0、20、40、60、80、100、200 和 300 μg/mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6 mL于10 mL的比色管中，加入稀釋10倍的福林酚試劑3 mL，然后加入7.5%碳酸鈉溶液2.4 mL，混勻，黑暗中放置30 min，在波長765 nm測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.010 4X+0.008 1，R2=0.999 3。

1.2.2.2 提取液中總酚含量的測定

取不同試驗條件下各組提取液，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，按照上述方法顯色，測定吸光值。將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中總酚含量。結(jié)果以每克山核桃外果皮粉末中含有相當(dāng)沒食子酸的質(zhì)量表示，即 mg/g。

1.2.3 單因素試驗

稱取一定量的山核桃外果皮粉末，研究乙醇濃度、微波功率、液料比和微波處理時間對山核桃外果皮總酚提取率的影響。

1.2.4 山核桃外果皮提取物抗氧化特性測定

按照優(yōu)化后的最佳工藝提取山核桃外果皮總酚，將提取液減壓濃縮并真空凍干后配置成不同濃度的樣品溶液進(jìn)行抗氧化活性測定，通過FC法測定提取物粉末中總酚含量為17.45%。

1.2.4.1 還原力的測定

還原力的測定參照Apati等［9］所報道的方法。分別吸取質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.3 和0.4 mg/ml的提取物溶液1 ml，依次加入 0.5 mol/L(pH 6.6)的磷酸鹽緩沖液 2.5 mL和 1%鐵氰化鉀溶液(K3Fe(CN)6)2.5 mL，于50℃水浴中保溫20 min，取出冷卻后，再加入10%三氯乙酸溶液(TCA)2.5 mL，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水，0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，充分混勻，靜置10 min后，在700 nm下測定其吸光度值，同時用BHT作對比試驗。還原力的IC50定義為:吸光值為0.5時樣品的濃度［10］。濃度越小，還原力越強。

1.2.4.2 DPPH 自由基清除率

山核桃外果皮提取物清除DPPH自由基能力的測定參照Hatano等［11］的方法。分別取0.3 mL質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.3 和 0.4 mg/mL 提取物溶液，與2.7 mL DPPH甲醇溶液(0.1 mmol/L)混合，充分混勻后在室溫下靜置2 h，在517 nm測吸光值A(chǔ)1，空白以提取劑代替樣品測得A0，同時以BHT作對比試驗。

1.2.4.3 抗油脂氧化作用的測定

利用β－胡蘿卜素的褪色程度來評價山核桃外果皮提取物抗油脂氧化作用，測定方法參照Shahsavari等［12］的方法稍加調(diào)整。稱取40 mg亞油酸和400 mg吐溫40于燒瓶內(nèi)，再加入3 mL β－胡蘿卜素溶液(5mg β－胡蘿卜素溶解于50mL氯仿)，搖勻。在35℃下，真空旋轉(zhuǎn)除去氯仿，加入100 mL重蒸水，混勻，得到β－胡蘿卜素亞油酸乳化液。

取0.2 mL不同質(zhì)量濃度的山核桃外果皮提取物溶液，加入上述配置好的乳化液4 mL，搖勻，將盛有上述溶液的比色管放置在50℃水浴鍋中。2 h后，在470 nm下，測定吸光值A(chǔ)sample。用不加β－胡蘿卜素的亞油酸乳化液作空白，不加提取物溶液的亞油酸乳化液作對照Acontol。同時以BHT作對比試驗。山核桃外果皮提取物的抗氧化活性(Antioxidant activity，簡稱AA)可以通過β－胡蘿卜素顏色變化(即吸光值)進(jìn)行計算，公式如下:

式中:Asample(2h)與Acontol(2h)為試樣和對照樣2 h后的吸光值，Acontol(0h)為對照樣在保溫初始時(t=0)的吸光值。

1.2.5 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗結(jié)果的平均值。采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，并用ANOVA進(jìn)行鄧肯氏多重差異分析(取P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山核桃外果皮總酚提取單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對總酚得率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g的山核桃外果皮干粉，按料液比 1∶30(g/mL)分別加入體積分?jǐn)?shù)為 0、20、40、60、80和100%的乙醇，在微波功率為640 W條件下提取60 s，抽濾，定容，計算總酚得率，試驗結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，40%和60%乙醇提取山核桃外果皮總酚得率無顯著差異，考慮經(jīng)濟(jì)因素，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

圖1 乙醇濃度對總酚得率的影響

2.1.2 料液比對總酚得率的影響

準(zhǔn)確稱取 6.00、3.00、2.00、1.50、1.20 和 1 g山核桃外果皮干粉，分別加入40%乙醇60 mL，在微波功率為640 W條件下提取60 s，抽濾，定容，計算多酚得率，試驗結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，隨著料液比的增大，山核桃外果皮總酚溶出率也增大，當(dāng)料液比大于1∶50時，總酚得率變化不大，綜合經(jīng)濟(jì)因素考慮確定料液比單因素最佳條件為1∶50。

圖2 料液比對總酚得率的影響

2.1.3 微波功率對總酚得率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g的山核桃外果皮干粉，按料液比1∶30(g/mL)加入40%乙醇，分別在微波功率0、160、320、480、640 和 800 W 條件下提取 60 s，抽濾，定容，計算多酚得率，試驗結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，微波功率在480 W時山核桃總酚得率最高。

圖3 微波功率對總酚得率的影響

2.1.4 微波時間對總酚得率的影響

準(zhǔn)確稱取2.00 g的山核桃外果皮干粉，按料液比1∶30(g/mL)加入40%乙醇，在微波功率640 W條件下，分別提取 20、40、60、80、100 和 120 s，抽濾，定容，計算多酚得率，試驗結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，微波時間100 s總酚得率最大。

圖4 微波時間對總酚得率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取山核桃外果皮總酚工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析因素的選取及分析方案

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，微波時間選定為100 s，對影響山核桃外果皮總酚提取率的主要因素(乙醇濃度、微波功率和液料比)進(jìn)行中心組合試驗(Box－Behnken)。試驗因素和水平設(shè)計見表1，試驗分析方案及結(jié)果見表2。

表1 Box－Behnken設(shè)計因素及水平表

表2 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

2.2.2 總酚提取工藝的模型建立及其顯著性檢驗

對表2中試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得二次多元回歸方程(模型)為:

對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，模型系數(shù)顯著性檢驗見表4。

表3 回歸模型方差分析

表4 回歸系數(shù)顯著性檢驗

由表3回歸模型方差分析可知，F(xiàn)回歸=56.51＞(F0.01(9，4)=14.66);P 值 ＜0.000 1，表明模型極顯著。F失擬=5.17 ＜ (F0.05(9，3)=8.81，失擬項 P=0.073＞0.05，表明失擬不顯著。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.969，說明該二次模型能夠擬合真實的試驗結(jié)果，試驗誤差小［13］。由表4回歸方程系數(shù)顯著檢驗可知，乙醇濃度的一次項、二次項、料液比的一次項、微波功率的一次項和二次項均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)，料液比和微波功率的交互項達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

乙醇濃度、料液比和微波功率交互作用對總酚得率的影響見圖5～圖7。由圖5可知，料液比不變，隨著乙醇濃度的增大，總酚得率呈先上升后下降的趨勢;乙醇濃度恒定，增大料液比有利于提高總酚得率。由圖6可知，微波功率不變，隨著乙醇濃度的增大，總酚得率同樣呈先上升后下降的趨勢;乙醇濃度恒定，隨著微波功率增大，總酚得率也呈先上升后下降的趨勢。由圖7可知，微波功率不變，總酚得率隨著料液比的增大呈線性增加;料液比恒定，總酚得率隨著微波功率增大而增加，但超過一定值后功率的增加對總酚得率有負(fù)面影響。

圖5 乙醇濃度與料液比對總酚得率影響的響應(yīng)面圖

再對三維非線性回歸模型(3)進(jìn)行求一階偏導(dǎo)，并令其為零，得出得率較高的條件:A=－0.20，B=1.0，C=0.14，轉(zhuǎn)化為實際參數(shù)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為56.0%，料液比為 1∶50，微波功率為 502.4 W，在此條件下總酚得率模型預(yù)測值為125.60 mg/g，驗證值為123.41 mg/g，兩者相對偏差為1.75% ＜5%。

2.3 山核桃外果皮提取物抗氧化特性

供給電子能力是酚類物質(zhì)抗氧化重要作用之一，還原力體系的機理就是通過測定抗氧化劑提供電子的多少，來評價抗氧化活性的強弱［14］。由圖8可知，提取物鐵還原力隨其濃度增加而上升，呈明顯的量效關(guān)系。提取物還原力的IC50為0.431 mg/mL，而BHT的IC50則為0.140 mg/mL，說明提取物還原力相當(dāng)于BHT的0.325倍。

DPPH已廣泛用來評價各自植物和化合物的清除自由基的能力［15］。由圖9可知，提取物的 DPPH清除能力隨著濃度的增大呈上升趨勢，當(dāng)提取物濃度達(dá)到一定值后，清除能力變化變緩。通過對提取物濃度和DPPH清除率進(jìn)行對數(shù)擬合，可得到提取物IC50(即清除率為50%時樣品的濃度)為0.136 mg/mL，BHT 的 IC50為 0.122 mg/mL，說明提取物清除DPPH自由基的能力與BHT相當(dāng)。β－胡蘿卜素亞油酸體系的機理，就是通過抗氧化劑中和亞油酸自由基和體系中其他的自由基，抑制了其對不飽和β－胡蘿卜素的攻擊，從而減緩了β－胡蘿卜素的褪色;抗氧化活性的強弱可以通過470 nm下吸光值的變化幅度來衡量［16］。由圖10可知，提取物抗油脂氧化能力隨著濃度的增大而增大。通過計算提取物的 IC50為 0.221 mg/g，BHT 的 IC50為 0.122 mg/g，說明提取物抗油脂氧化能力弱于BHT。

圖10 提取物質(zhì)量濃度與抗油脂氧化能力的關(guān)系

3 結(jié)論

山核桃外果皮總酚提取最佳工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)56.0%，料液比1∶50，微波功率502.4 W，微波時間100 s。在此條件下總酚得率模型預(yù)測值為125.60 mg/g，驗證值為 123.41 mg/g，重復(fù)性試驗結(jié)果較好，真空冷凍干燥后提取物總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.45%。提取物還原力和抗油脂氧化能力弱于BHT，但對DPPH自由基的清除能力與BHT相當(dāng)，因此山核桃外果皮提取物具有較強的抗氧化活性，是一種具有開發(fā)潛力的天然抗氧化劑。

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Study on Optimization of Microwave－Assisted Extraction of Total Phenol in Exocarp of Carya Cathayensis and its Antioxidant Activities

Wu Fenghua1，2Luo Zisheng1He Zhiping2Pang Linjiang2
(College of Biosystem Engineering and Food Science，Zhejiang University1，Hangzhou 310029)
(School of Agriculture and Food Science，Zhejiang A ＆ F University2，Lin'an 311300)

Based on the single － factor experiment，the method of response surface analysis with 3 factors including ethanol concentration，solvent－material ratio and microwave power on the yield of total phenol was adopted.The antioxidant of extract was studied in three different systems(reducing power，1，1 － diphenyl－ 2 － picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging activity and β －Carotene bleaching).The optimal conditions of microwave －assisted extraction were as follows:ethanol concentration 56.0%，solvent－material ratio 1∶50，microwave power 502.4 W and time 100 s;the actual value of total phenol was 123.41 mg/g，in close agreement with the value predicted by the mathematical model.The exocarp of Carya cathayensis extract obtained at the optimal conditions exhibited a strong scavenging DPPH ability comparable to BHT.

exocarp of Carya cathayensis，total phenol，extraction，response surface methodology，antioxidant

TQ432.2

A

1003－0174(2011)08－0109－06

浙江省自然科學(xué)基金 (Y3090428、Y3100422)，浙江林學(xué)院科研發(fā)展基金(2290000027)

2010－10－19

吳峰華，男，1979年出生，實驗師，農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工

羅自生，男，1972年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品采后生物學(xué)