王 偉， 張 芳， 謝 悅， 張宜乾， 吳樹明

(1徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科，江蘇 徐州 221002；2江蘇省中醫(yī)藥研究院風(fēng)濕免疫科，江蘇 南京 210028；3山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心臟外科，山東 濟(jì)南 250012)

外源性HGF基因轉(zhuǎn)染對肺動(dòng)脈高壓兔肺血流灌注及肺動(dòng)脈壓力的影響*

王 偉1△▲， 張 芳2▲， 謝 悅1， 張宜乾1， 吳樹明3

(1徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科，江蘇 徐州 221002；2江蘇省中醫(yī)藥研究院風(fēng)濕免疫科，江蘇 南京 210028；3山東大學(xué)齊魯醫(yī)院心臟外科，山東 濟(jì)南 250012)

目的探討外源性肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因轉(zhuǎn)染高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓家兔后促進(jìn)側(cè)支肺血管生成、改善肺血流灌注、降低肺動(dòng)脈壓力的可行性。方法將肺動(dòng)脈高壓兔隨機(jī)分為對照組、空病毒組和HGF基因轉(zhuǎn)染組；HGF基因轉(zhuǎn)染組經(jīng)氣管內(nèi)滴入法轉(zhuǎn)染Ad-HGF，對照組和空病毒組分別氣管內(nèi)滴入同體積PBS液和Adeno-Null；4周后，通過MacLab/8s多功能生理儀行血流動(dòng)力學(xué)檢測，通過抗FⅧ+α-SMA抗體免疫熒光雙標(biāo)檢測肺小動(dòng)脈密度、FITC-lectin灌注+抗α-SMA熒光雙標(biāo)記了解肺血管灌注情況。結(jié)果氣管內(nèi)給藥4周后，HGF基因治療組含平滑肌細(xì)胞的小動(dòng)脈密度較肺動(dòng)脈高壓對照組和空病毒組(12.5±2.7)/mm2明顯增多(Plt;0.05)；HGF組肺血流灌注獲得有效改善，而肺動(dòng)脈高壓對照組和空病毒轉(zhuǎn)染組肺血管仍處于狹窄甚至閉塞狀態(tài)；HGF治療組肺動(dòng)脈平均壓明顯低于肺動(dòng)脈高壓對照組和空病毒轉(zhuǎn)染組(Plt;0.05)。結(jié)論肺動(dòng)脈高壓模型動(dòng)物經(jīng)氣管滴入法轉(zhuǎn)染外源性HGF，可以促進(jìn)肺側(cè)支血管生成，增加肺灌注并有效降低肺動(dòng)脈壓力。

肝細(xì)胞生長因子； 血管新生； 基因治療； 肺動(dòng)脈高壓

高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓是左向右分流型先心病常見并發(fā)癥[1]。目前認(rèn)為，在其形成的早期，及時(shí)手術(shù)矯治心內(nèi)畸形，可阻止肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)一步發(fā)展[2]。由于醫(yī)療條件所限，現(xiàn)階段我國存在大批高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓病人。肺動(dòng)脈在長期高血流的沖擊下，出現(xiàn)肌層增厚、纖維化、血管床逐步減少，病變進(jìn)入到不可逆階段，傳統(tǒng)的擴(kuò)血管治療將失去意義。目前，國內(nèi)外很多學(xué)者都把目光投向改善血管重構(gòu)、促進(jìn)血管再生的研究上，這是當(dāng)前肺動(dòng)脈高壓研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)，也是糾治其病理演變的希望所在。

肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)作為一種高效的促血管生成因子，目前已被廣泛應(yīng)用于缺血性疾病的治療上[3,4]。本研究在家兔高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓模型上，經(jīng)氣管途徑轉(zhuǎn)染人HGF基因(h-HGFcDNA)，觀察在肺動(dòng)脈高壓形成的特定病理改變下，外源性基因促進(jìn)側(cè)支血管建立、改善肺組織血流灌注并降低肺動(dòng)脈壓力的作用，為高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓的治療提供新思路。

材 料 和 方 法

1材料

1.1基因 攜帶HGF基因的重組腺病毒(Ad-HGF)和不攜帶HGF基因的空病毒(Adeno-Null)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院合成，吳祖澤院士惠贈(zèng)。該病毒是復(fù)制缺陷的人血清5型腺病毒，含CMV啟動(dòng)子，Ad-HGF病毒感染滴度為9×1013pfu/L，Adeno-Null病毒感染滴度為1.1×1014pfu/L。

1.2肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型 1月齡幼兔，雌雄不拘，體重(540±24) g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。麻醉下前胸正中開胸，行左頸總動(dòng)脈與肺動(dòng)脈主干吻合，形成體-肺動(dòng)脈分流，3月后建立高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓模型[5]。

1.3主要試劑及儀器

① 主要試劑 HE染色試劑盒(北京中杉金橋公司)、FITC-lectin(Sigma)、小鼠抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體(mouse anti-rat α-SMA antibody,武漢博士德生物工程有限公司)、羅丹明標(biāo)記山羊抗鼠熒光Ⅱ抗(rhodamine-labeled goat anti-mouse fluorescent secondary antibody,北京中杉金橋公司)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate， FITC)標(biāo)記山羊抗小鼠熒光Ⅱ抗(FITC-labeled goat anti-mouse fluorescent secondary antibody,北京中杉金橋公司)和鼠抗人HGF單克隆抗體 (mouse anti-human HGF monoclonal antibody，Aamp;D)。

② 主要儀器 MacLab hemodynamic recording system(Instruments)，Micron石蠟切片機(jī)(Leica)，CK40倒置顯微鏡(Olympus)，PM-CB20顯微照相系統(tǒng)(Olympus)。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組及劑量設(shè)置 在進(jìn)行藥效研究時(shí)，高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓家兔隨機(jī)分成3組，每組12只。具體處理如下：

(1)對照組(C組)：氣管內(nèi)滴入PBS液0.2 mL；(2)空病毒對照組(N組):氣管內(nèi)滴入Adeno-Null 2×109pfu/只；(3)HGF治療組(H組):氣管內(nèi)滴入Ad-HGF2×109pfu/只。

2.2血流動(dòng)力學(xué)變化檢測 給藥1月后，經(jīng)動(dòng)物耳緣靜脈推注硫噴妥鈉麻醉。原切口開胸，于升主動(dòng)脈及肺動(dòng)脈主干分別用7-0無損傷單絲線縫荷包，插入4F測壓管，通過Mac-Lab/8s多功能生理儀同步監(jiān)測血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，包括：肺動(dòng)脈收縮壓(pulmonary artery systolic pressure,PASP)、肺動(dòng)脈舒張壓(pulmonary artery diastolic pressure,PADP)、肺動(dòng)脈平均壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)及主動(dòng)脈平均壓(mean systemic arterial pressure,mSAP)。

2.3抗FⅧ+α-SMA抗體免疫熒光雙標(biāo)檢測肺血管形態(tài) 石蠟切片，常規(guī)脫蠟復(fù)水，于枸櫞酸鈉中抗原熱修復(fù)(95 ℃ 2 min)。3% H2O2室溫浸泡10 min。室溫下，0.01 mol/L PBS 緩沖液( pH 7.4)沖洗切片，5 min×3；5%BSA封閉(37 ℃ 1 h)，傾去勿洗；將α-平滑肌肌動(dòng)蛋白Ⅰ抗(鼠抗兔，1∶100)和Ⅷ因子相關(guān)抗原Ⅰ抗(兔抗人)按1∶1的比例混勻，滴加在切片上4 ℃過夜。(以下所有步驟注意避光)將羅丹明標(biāo)記山羊抗小鼠熒光Ⅱ抗(1∶200)和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠熒光Ⅱ抗按1∶1的比例混勻滴加在切片上，37 ℃孵育1 h。室溫下，0. 01 mol/L PBS 緩沖液( pH 7.4)沖洗切片，熒光顯微鏡觀察并拍照。200倍鏡下每張切片隨機(jī)選取3-4個(gè)視野拍照，以Image-Pro plus 6.0軟件對免疫組化照片進(jìn)行綠色(FⅧ)和紅色(α-SMA)熒光陽性區(qū)域計(jì)數(shù)。

2.4肺血管灌注檢測 FITC-lectin灌注： 各組動(dòng)物行肺動(dòng)脈測壓后，剪開左心房，自測壓管注入0.1%PBS沖洗肺血干凈后，取左肺(盡量不要損傷肺，注意保留肺門結(jié)構(gòu))，以測壓管經(jīng)左肺動(dòng)脈注入FITC-lectin溶液，待lectin自左肺靜脈流出時(shí)結(jié)扎左肺動(dòng)靜脈。取肺組織邊緣區(qū)組織，4%多聚甲醛浸泡固定(4 ℃)。6 h后浸泡30%蔗糖過夜。待浸泡蔗糖沉底后冰凍切片(40 μm)，室溫下，0.01 mol/L PBS 緩沖液(pH 7.4)漂洗后加入α-平滑肌肌動(dòng)蛋白Ⅰ抗(兔抗大鼠，1∶100)4 ℃過夜；漂洗后加入羅丹明標(biāo)記山羊抗兔熒光Ⅱ抗(1∶200)室溫孵育1 h；熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.5血?dú)夥治黾坝倚氖曳屎裰笜?biāo)檢測 各組動(dòng)物給藥后4周，開胸時(shí)抽取動(dòng)脈血，行血?dú)夥治觥?dòng)物處死后切取心臟， 沿右心室與室間隔相連處剪開心臟，分離出右心室(right ventricle,RV)和左心室+室間隔(left ventricular and septum,LV+S)，用濾紙吸干水分后用電子天平分別稱重(WRV和WLV+S),計(jì)算WRV/WLV+S的值[6]。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1血流動(dòng)力學(xué)變化

1月后，HGF治療組肺動(dòng)脈平均壓[(15.4 ± 3.4)mmHg]明顯低于對照組[(21.1 ± 2.6) mmHg]和空病毒轉(zhuǎn)染組[(22.0±2.8)mmHg]，見表1。

2抗FⅧ因子與抗α-SMA免疫熒光雙標(biāo)檢測新生血管密度及形態(tài)

以抗FⅧ因子與抗α-SMA熒光雙標(biāo)檢測新生血管密度與形態(tài)，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過抗FⅧ因子以FITC標(biāo)記，呈綠色熒光；平滑肌細(xì)胞通過抗α-SMA以羅丹明標(biāo)記，呈紅色熒光,見圖1。

對照組：紅色熒光標(biāo)記的血管平滑肌細(xì)胞數(shù)目[(10.5±3.2)/mm2]較少，部分呈實(shí)性光斑，表明有動(dòng)脈管腔閉塞現(xiàn)象，標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞的綠色熒光暗淡，呈散在點(diǎn)樣分布。空病毒組：與對照組比較，血管平滑肌細(xì)胞數(shù)[(12.5±2.7)/mm2]無明顯增加，同樣存在管腔閉塞現(xiàn)象，綠色熒光標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞分布和數(shù)量無明顯變化。HGF組:血管平滑肌細(xì)胞數(shù)目[(18.5±3.1)/mm2]明顯增多，且管腔結(jié)構(gòu)完整。內(nèi)皮細(xì)胞的綠色熒光較強(qiáng)，呈片狀分布。與前兩組比較，差異顯著。

表1 治療后各組血流動(dòng)力學(xué)變化

3FITC-lectin灌注與抗α-SMA免疫熒光標(biāo)記檢測血管功能與結(jié)構(gòu)

Lectin帶有FITC標(biāo)記(呈綠色熒光)，經(jīng)肺動(dòng)脈灌注可以標(biāo)記具有管腔且有血流通過的血管，肺動(dòng)脈及支氣管的平滑肌細(xì)胞通過抗α-SMA以羅丹明標(biāo)記，呈紅色熒光。結(jié)果表明：對照組和空病毒組肺組織內(nèi)肌型肺小動(dòng)脈稀少，管腔狹窄，血流灌注差。HGF組血流灌注豐富，肌型肺小動(dòng)脈明顯增多，與對照組和空病毒組比較差異顯著，見圖2。

4血氧分壓及右心室厚度的變化

HGF組動(dòng)脈血氧分壓升高，與對照組和空病毒組比較，差異顯著。HGF組右心室厚度(WRV/WLV+S)與對照組、空病毒組比較未見顯著差異，見表2。

Figure 2. Double-labeling immunofluorescence of FITC-lectin pulmonary perfusion and anti α-SMA(×200).A: contral group;B：Ad-Null group;C:Ad-HGF group. Lectin labeled with FITC in the lung vessels showed green fluorescence.Smooth muscle cells with rhodamine labeled α-SMA antibody showed red fluorescence.

表2 各組間動(dòng)脈血氧分壓及右心室厚度的比較

討 論

高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓形成的確切機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為，肺血管受到高血流沖擊時(shí)，由于機(jī)械應(yīng)力的刺激，出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肺小動(dòng)脈平滑肌過度增殖，從而造成管腔狹窄甚至閉鎖及進(jìn)行性肺血管床減少，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓的形成。由于中、晚期肺動(dòng)脈高壓患者肺血管中層的增厚和平滑肌纖維化，傳統(tǒng)的擴(kuò)血管治療效果不理想。近年來，血管新生治療已成為多個(gè)研究領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)，尤其對于器官的缺血性病變，通過體外轉(zhuǎn)染血管生成基因誘導(dǎo)新生血管形成(治療性血管新生)改善組織或器官的灌注，減少血流阻力而達(dá)到治療目的[7,8]。

我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶外源性基因的腺病毒經(jīng)支氣管內(nèi)滴入，2周后目的基因可出現(xiàn)在支氣管上皮、肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，并通過旁分泌的方式在局部形成作用。該方法具有轉(zhuǎn)染效率高、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)[9]。

肺動(dòng)脈高壓所致肺血管重構(gòu)中，肺腺泡內(nèi)動(dòng)脈是調(diào)控肺血流動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵血管，它在形態(tài)學(xué)上包括肌型、部分肌型和非肌型3種不同結(jié)構(gòu)的血管段。其中部分肌型、非肌型肺動(dòng)脈肌型化，管壁增厚，管腔狹窄是肺高壓形成的病理基礎(chǔ)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ad-HGF轉(zhuǎn)染后4周，肺組織病理觀察可見肌性和部分肌性肺小動(dòng)脈較對照組明顯增多，且管腔結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細(xì)胞分別均勻，為肺動(dòng)脈側(cè)支血管建立提供直接證據(jù)。

本研究中，我們采用FITC-lectin與抗α-SMA免疫熒光雙標(biāo)記法檢測新生血管是否具備血流灌注功能。Lectin能特異地與血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜上的N-乙酰-β- D -氨基葡萄糖寡聚體共軛結(jié)合，且本身帶有FITC綠色熒光標(biāo)記，經(jīng)肺動(dòng)脈灌注可以精確標(biāo)記具有管腔且有血流通過的血管，而肺血管及支氣管平滑肌細(xì)胞則通過抗α-SMA以羅丹明標(biāo)記，呈紅色熒光。研究表明，外源性HGF基因轉(zhuǎn)染后4周，肺組織內(nèi)功能肺血管明顯增多，肺灌注得到有效改善，結(jié)合血?dú)夥治鼋Y(jié)果，肺氧和能力亦得以提升。

在相同的干預(yù)條件下，肺動(dòng)脈壓力檢測顯示，HGF基因治療組肺動(dòng)脈壓力明顯低于對照組和空病毒組，推測治療組肺動(dòng)脈壓力下降與新的側(cè)支循環(huán)建立、增加了肺血管床截面積有關(guān)。同時(shí)，不排除肺灌注改善后，氧和能力提高對肺動(dòng)脈痙攣的緩解作用。其確切機(jī)制及作用時(shí)效仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

目前，肺動(dòng)脈高壓的基因治療尚處于實(shí)驗(yàn)階段，隨著分子生物學(xué)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展，基因治療即將取得突破性進(jìn)展，并有望為肺動(dòng)脈高壓這一難治之癥提供新的治療途徑。

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EffectofexogenousHGFgenetransfectiononpulmonaryperfusionandpressureinpulmonaryarteryhypertensioninrabbits

WANG Wei1, ZHANG Fang2, XIE Yue1, ZHANG Yi-qian1, WU Shu-ming3

(1DepartmentofCardiothoracicSurgery,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China;2DepartmentofRheumatology,JiangsuProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210028,China;3DepartmentofCardiovascularSurgery,QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:wangwei-doctor@163.com)

AIM: To investigate the feasibility of exogenous hepatocyte growth factor (HGF) gene transfection to promote pulmonary collateral angiogenesis, improve pulmonary perfusion and reduce pulmonary artery pressure in the rabbit model of pulmonary artery hypertension (PAH).METHODSThe model rabbits of PAH were randomly divided into control group, empty vector group andHGFgene transfection group. The rabbits inHGFgene transfection group were transfected with Ad-HGFvia intratracheal instillation. Pulmonary hemodynamic indicators were monitored in the 4th week afterHGFgene transfection. Density of pulmonary vessels was examined with double-labeling immunofluorescence (endothelial cells were labeled with anti-FⅧ and vascular smooth muscle cells were marked with anti-α-SMA). Double-labeling immunofluorescence of FITC-lectin and anti-α-SMA was also performed to evaluate the pulmonary blood perfusion.RESULTSFour weeks after transfection, the density of pulmonary arterioles of the rabbits inHGFgene transfection group was higher than that in control group and empty vector group (Plt;0.05), which was confirmed by double-labeling immunofluorescence. Pulmonary blood perfusion inHGFgroup was significantly increased compared with that in the other two groups, in which pulmonary arterial stenosis and occlusion were observed. The mean pulmonary artery pressure inHGFtransfection group was much lower than that in control group and empty vector group (Plt;0.05).CONCLUSIONFour weeks after intratracheal adenoviral-mediatedHGFgene transfection, pulmonary collateral vessels and pulmonary perfusion increase, and the pulmonary artery pressure is effectively reduced.

Hepatocyte growth factors; Angiogenesis; Gene therapy; Pulmonary artery hypertension

1000-4718(2011)11-2217-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.035

2011-05-25

2011-09-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30571845)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.BK2007033)；江蘇省高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.07KJD310218)；徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.XM09B072)

△通訊作者 Tel：0516-85802040;E-mail:wangwei-doctor@163.com

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