王 婷 楊 旭 (鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科,河南 鄭州 45004)

王漿作為保健品,其保存條件受到關(guān)注,上世紀 90年代Chen等〔1〕檢測了 -20℃、4℃和室溫條件下 7個月內(nèi)王漿質(zhì)量的變化,發(fā)現(xiàn)在室溫下王漿發(fā)生褐變,黏性顯著增加,水溶性蛋白發(fā)生降解,而在 -20℃下變化不大,并采用 SDS-PAGE技術(shù)檢測出 4～5種蛋白隨著溫度的升高和時間的延長而逐漸降解。Kamakura等〔2〕利用色譜和 PAGE技術(shù)比較不同儲存條件下王漿蛋白成分,發(fā)現(xiàn)一種 57 kD糖蛋白可作為王漿新鮮度的指標。此糖蛋白的降解速度與儲存溫度和儲存時間成正比。本研究利用雙向電泳技術(shù)分析在室溫下儲存 30 d以及室溫、4℃、-20℃各儲存 80 d的王漿蛋白質(zhì)組分之變化,以期探明不同儲存溫度對王漿蛋白成分的影響,這將為科學(xué)合理的儲存和利用王漿奠定基礎(chǔ),并進一步探索王漿新鮮度評價指標。

1 材料與方法

1.1 樣品 所有王漿樣品均取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所實驗蜂場。王漿從臺基中取出立即裝入無菌 Ep管中,分別冷凍于 -20℃、冷藏于 4℃、存放在室溫下。

1.2 蛋白提取和蛋白濃度測定 室溫儲存 30 d以及室溫、4℃和 -20℃儲存 80 d的王漿提取總蛋白。蛋白提取方法根據(jù)鐘伯雄等〔3〕報道的方法稍做改良,提取的蛋白樣品溶液直接使用或是 -70℃冷藏備用。采用 Bradford法進行蛋白質(zhì)濃度測定,595 nm波長處測定吸收值。

1.3 雙向電泳 (2-DE)和圖像分析 使用 17 cm IPG膠條 (pH 3～10線性),在 18℃按以下程序進行第一向等電聚焦 (PROTEAN IEF Cell,Bio-Rad Hercules,CA,USA):50V,主動水化 14 h;250 V,除鹽 30 m in ×4次;1 000 V,60 m in再次除鹽;9 000V,線性升壓 5 h;9 000 V,聚焦 60 000 V/h。第一向聚焦結(jié)束后,將IPG膠條用平衡緩沖液平衡,然后進行第二向電泳 (PROTEANⅡ xi Cell,Bio-Rad Hercules,CA,USA):恒流 25 mA/gel。電泳結(jié)束后用 CBB G-250進行凝膠染色。每個樣品重復(fù) 5次雙向電泳。染色后凝膠使用透射模式進行掃描 (PDQuest V 7.3.0,Bio-Rad Hercules,CA,USA),并用總密度方法標準化處理。

用 ANOVA 6.12(SAS Institute,Cary,N.C.,USA)比較 4個樣品中經(jīng)標準化處理的共有蛋白點含量。

2 結(jié) 果

結(jié)果顯示室溫儲存 30 d的王漿以及室溫、4℃和 -20℃儲存 80 d的王漿蛋白點總數(shù)分別為 63(圖 1A)、69(圖 1B)、45(圖1C)和 75(圖 1D)個,分子量范圍為 7.64～72.33 kD,等電點在4.95～8.70范圍內(nèi)。

與此前發(fā)表過的王漿蛋白質(zhì) 2-DE圖譜進行比較定位王漿主蛋白 (Apalbum in)〔4〕,分析它們在不同儲存條件下的含量變化。Apalbum in 1在各儲存條件下均為過飽和點。Apalbum in 2和Apalbum in 3在各儲存條件下的含量變化不規(guī)律:在 -20℃條件下含量最高或者只出現(xiàn)在 -20℃的蛋白點共有 18個;在4℃條件下含量最高或只出現(xiàn)在 4℃的蛋白點共有 13個;只出現(xiàn)在室溫 30 d或者在室溫 30 d條件下含量最高的蛋白質(zhì)點有5個;只出現(xiàn)在室溫 80 d或者在室溫 80 d條件下含量最高的蛋白質(zhì)點有 14個。7個 Apalbum in 4蛋白點和 3個葡萄糖氧化酶蛋白點只在 -20℃下可見。蛋白點 Apalbum in 5在 4℃條件下可見 3個;在 -20℃可見 6個;在兩種室溫條件下未見 Apalbum in 5蛋白點。

圖 1 不同儲存條件下王漿蛋白雙向電泳圖譜

3 討 論

Apalbum in 1在本次實驗的 4種儲存條件下均為過飽和點,說明對于溫度和時間這兩個儲存條件不敏感。4種儲存條件下共有的 Apalbum in 2和 Apalbumin 3蛋白含量并未隨著儲存溫度的升高和時間的延長而發(fā)生明顯減低,有的反而在室溫 80 d條件下含量最高,這可能是王漿蛋白發(fā)生聚集的緣故,也可能是 Apalbumin 2和 Apalbumin 3多態(tài)性的表現(xiàn)〔1〕。Apalbum in 1主要是促進肝細胞再生、保護肝細胞及營養(yǎng)功能;Apalbum in 2和 Apalbumin 3的功能是氮儲存,同時 Apalbum in 3還具有免疫調(diào)節(jié)作用〔5,6〕,這 3種王漿主蛋白對儲存溫度不敏感,所以常溫儲存也許不會對它們的功能產(chǎn)生太大影響。Apalbum in 4和葡萄糖氧化酶的蛋白點只出現(xiàn)在 -20℃80 d條件下,其余 3種儲存條件均未見,表明 Apalbum in 4和葡萄糖氧化酶對于溫度非常敏感。就 Apalbumin 4的溫度敏感性和本次實驗所測得的分子量 54.57～59.10 kD來看,與 Kamakura等〔2〕報道的一種可作為王漿新鮮度指標的 57 kD糖蛋白基本吻合。在 Sano〔7〕之前一直未能用雙向電泳的方法鑒定出 Apalbumin 4的存在,可能是因為其溫度敏感性,在樣品收集、運輸或者制備過程中發(fā)生了降解。本實驗所用王漿從臺基收集后立即存放于 -20℃,4℃、室溫,因此最大程度減少了中間環(huán)節(jié),保證樣品的新鮮。Apalbumin 5出現(xiàn)于 4℃和 -20℃ 80 d條件下,而室溫 30 d和80 d未見,并且在 4℃條件下的蛋白點含量明顯低于 -20℃,說明Apalbumin 5對儲存溫度比較敏感,但敏感性沒有 Apalbumin 4和葡萄糖氧化酶高。Apalbum in 4和 Apalbum in 5的功能是以必需氨基酸形式提供營養(yǎng)〔3〕,但由于它們的溫度敏感性,必需冷藏才有可能保持其活性。

Apalbumin 1、Apalbum in 2和 Apalbum in 3對儲存溫度不敏感,而 Apalbum in 4、Apalbum in 5和葡萄糖氧化酶對儲存溫度敏感,可作為王漿新鮮度評價指標的參考。

1 Chen C,Chen SY.Changes in p ro tein componen ts and storage stab ility of royal jelly under various conditions〔J〕.Food Chem,1995;54(2):195-200.

2 Kamakura M,Fukuda T,Fukushima M,et a l.Sto rage-dependent degradation of 57-kDa p rotein in royal jelly:a possib le marker for freshness〔J〕.BiosciBiotechno lBiochem,2001;65(2):277-84.

3 Zhong BX,Li JK,Lin JR,et a l.Possible effect of 30K p roteins in embryonic development of silkwo rm Bombyx mo ri〔J〕.Acta Biochim Biophys,2005;37(5):355-61.

4 Scarselli R,Donadio E,Giuffrida MG,et a l.Towards royal jelly p roteome〔J〕.Proteomics,2005;5(3):769-76.

5 蘇松坤,陳盛祿 .意蜂王漿生產(chǎn)性能形態(tài)學(xué)遺傳標記的研究〔J〕.遺傳,2003;25(6):677-80.

6 Simuth J.Some p ropertiesof themain p rotein of honeybee royal jelly〔J〕.Ap idologie,2001;32(1):69-80.

7 Sano O,Kunikata T,Kohno K,et a l.Characterization of royal jelly p roteins in both africanized and european honeybees(Ap is mellifera)by two-dimensional gel electrophoresis〔J〕.J Agric Food Chem,2004;52(1):15-20.