劉純真 王云龍 景建洲

摘要：根據(jù)單增李斯特菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）的ｈｌｙ、ｐｒｆＡ和ｉａｐ基因設(shè)計(jì)了３對(duì)常規(guī)引物和ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）引物，采用多重ＰＣＲ的方法，建立了單增李斯特菌的快速檢測(cè)體系，并比較了常規(guī)引物和ＤＰＯ引物的優(yōu)劣，結(jié)果表明ＤＰＯ引物的特異性強(qiáng)，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)單增李斯特菌。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)卧隼钏固鼐?；ＤＰＯ（Ｄｕａ?ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）引物；多重ＰＣＲ

中圖分類號(hào)：Ｒ３７８文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）15－3197-04

Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ DPO Primers

ＬＩＵ Ｃｈｕｎ－ｚｈｅｎ１，ＷＡＮＧ Ｙｕｎ－ｌｏｎｇ２，ＪＩＮＧ Ｊｉａｎ－ｚｈｏｕ１

（１． Food and Bioengineering School Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｅｎａｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＤＰＯ） ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｇｅｎｅs， ｈｌｙ， ｐｒｆＡ ａｎｄ ｉａｐ， ｏｆ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）， ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ 3 pairs of ｒｅｇｕｌａｒ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＤＰＯ primers ｈａｄ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ primers， could detect L. monocytogenes accurately and quickly．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ； ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ） ｐｒｉｍｅｒｓ； ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ，簡(jiǎn)稱單增李斯特菌）是危害公共衛(wèi)生和食品行業(yè)的一種重要人畜共患病致病菌，使人和動(dòng)物患腦膜炎、腦炎、敗血癥及造成孕婦流產(chǎn)、死胎等疾病，病死率很高。它能夠耐受低ｐＨ、高鹽環(huán)境，并且能在較寬溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)［１］。近年來(lái)，很多的突發(fā)病例都與消費(fèi)的食品被單增李斯特菌污染有關(guān)。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)單增李斯特菌對(duì)于預(yù)防這些疾病的發(fā)生至關(guān)重要。目前，ＰＣＲ技術(shù)被廣泛應(yīng)用于單增李斯特菌的檢測(cè)。多重ＰＣＲ是在常規(guī)ＰＣＲ基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來(lái)的一種新型ＰＣＲ擴(kuò)增技術(shù)，是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多條目的ＤＮＡ片段的方法［２］，采用這一技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多種病原微生物。多重ＰＣＲ雖為一種特異靈敏、簡(jiǎn)便快速、高通量的檢測(cè)技術(shù)，但如果實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或非特異性產(chǎn)物［３］；引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)榷伎赡芙档推潇`敏度和特異性。

近年來(lái)，一種新興的ＤＰＯ（Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）技術(shù)，既可保證擴(kuò)增的特異性，又可大大提高擴(kuò)增效率，為多重ＰＣＲ技術(shù)的應(yīng)用提供了新的前景［４］。本研究采用ＤＰＯ技術(shù)，建立了多重ＰＣＲ檢測(cè)體系，以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測(cè)單增李斯特菌的目的。

１材料與方法

１．１材料與儀器

菌種：?jiǎn)卧隼钏固鼐ǎ牵桑停保玻玻福┵?gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心；試劑：１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ購(gòu)于寶生物工程有限公司；設(shè)備：梯度ＰＣＲ儀（美國(guó)ＡＢＩ公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)ＵＬＴＲＡ． ＬＵＭ．Ｉｎｃ）。

１．２引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)單增李斯特菌的ｈｌｙ、ｐｒｆＡ、ｉａｐ基因的保守序列［５－７］分別設(shè)計(jì)３對(duì)常規(guī)引物以及相應(yīng)的ＤＰＯ引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體如下（表１）。

１．３實(shí)驗(yàn)方法

１．３．１單增李斯特菌ＤＮＡ的提?。茫瑁澹欤澹保埃胺ㄌ崛卧隼钏固鼐模危粒郏福?。Ｃｈｅｌｅｘ－１００作為一種離子螯合劑，由苯乙烯和苯二乙烯組成。其懸液在堿性環(huán)境（ｐＨ １０～１１）和１００ ℃的條件下，可導(dǎo)致細(xì)胞膜的破裂和ＤＮＡ的變性并釋放出來(lái)。①取適量細(xì)菌到１．５ ｍＬ離心管中，加入５００ μＬ純水，劇烈振蕩，室溫下放置１５ ｍｉｎ。②１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心３ ｍｉｎ，去上清，收集沉淀（必要時(shí)可用蒸餾水反復(fù)洗沉淀物，直至無(wú)色或色素很少）。③沉淀中加入２００ μＬ ５％ Ｃｈｅｌｅｘ－１００溶液（使用前充分振搖，使Ｃｈｅｌｅｘ－１００顆粒懸?。?，在振蕩器上反復(fù)振蕩，５６ ℃保溫３０ ｍｉｎ以上。④取出后振蕩，１００ ℃保溫８ ｍｉｎ，振蕩后１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心３ ｍｉｎ，取上清液用于ＰＣＲ擴(kuò)增，或放４ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．３．２３重ＰＣＲ反應(yīng)條件的優(yōu)化以單增李斯特菌ＤＮＡ為模板，分別對(duì)常規(guī)引物和ＤＰＯ引物的３重ＰＣＲ的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化并比較。反應(yīng)體系為２５ μＬ，包括１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋ ２．０ μＬ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２．０ μＬ，３對(duì)１０ μｍｏｌ／Ｌ引物各０．５ μＬ，３ Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶０．５ μＬ。對(duì)ＰＣＲ反應(yīng)的退火溫度、Ｍｇ２＋濃度、引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化。

１．３．３ＤＰＯ引物與常規(guī)引物的特異性檢測(cè)以金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌亞Ⅰ型、金黃色葡萄球菌亞Ⅱ型、沙門(mén)氏菌、乙型沙門(mén)氏菌、甲型沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、威爾氏李斯特菌、痢疾志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌、大腸桿菌（肉中提取、ＪＭ１０９、ＡＴＣＣ２５９２２、大腸桿菌Ｏ１５７）的ＤＮＡ為模板，分別用３個(gè)基因的常規(guī)和ＤＰＯ引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，所得的ＰＣＲ產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

１．３．４ＤＰＯ引物多重ＰＣＲ的靈敏度檢測(cè)將單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，通過(guò)ＬＢ瓊脂平板計(jì)數(shù)測(cè)菌落數(shù)。將菌樣分別用超純水進(jìn)行倍比稀釋，１２ ０００ ｒ/min離心２ ｍｉｎ，采用Ｃｈｅｌｅｘ－１００法抽提ＤＮＡ。ＰＣＲ反應(yīng)程序?yàn)椋海梗?℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，５８ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃延伸５０ ｓ，３０個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ。取ＰＣＲ產(chǎn)物７ μＬ進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（６０ Ｖ １ ｈ），照相觀察和分析。

２結(jié)果與分析

２．１３重ＰＣＲ反應(yīng)條件

２．１．１退火溫度對(duì)常規(guī)引物和ＤＰＯ引物的３重ＰＣＲ的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，電泳結(jié)果見(jiàn)圖１、圖２，兩種引物在５５～５９ ℃之間都能擴(kuò)增出目的條帶，但ＤＰＯ引物擴(kuò)增出的條帶亮度更好。

２．１．２Ｍｇ２＋ 濃度對(duì)常規(guī)引物和ＤＰＯ引物的３重ＰＣＲ的Ｍｇ２＋濃度進(jìn)行優(yōu)化，電泳結(jié)果見(jiàn)圖３、圖４。Ｍｇ２＋濃度較低時(shí)，兩種引物都僅能擴(kuò)增出２條目的條帶；Ｍｇ２＋濃度大于２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ時(shí)，ＤＰＯ引物擴(kuò)增出３條目的條帶，而常規(guī)引物擴(kuò)增出非特異性條帶。由此可見(jiàn)Ｍｇ２＋對(duì)ＤＰＯ引物的影響較小，用ＤＰＯ引物擴(kuò)增時(shí)，在較高Ｍｇ２＋濃度條件下也能保證擴(kuò)增的特異性。此后的反應(yīng)中，在２５ μＬ ３重ＰＣＲ反應(yīng)體系中添加Ｍｇ２＋濃度為１．８ ｍｍｏｌ／Ｌ。

２．１．３引物濃度由圖5和圖6可知，不同濃度的常規(guī)引物和ＤＰＯ引物都能擴(kuò)增出３條目的條帶，都有很強(qiáng)的特異性。此后的反應(yīng)中，在２５ μＬ ３重ＰＣＲ擴(kuò)增體系中添加３種引物的上下游引物濃度都為２００ ｎｍｏｌ／Ｌ。

２．２ＤＰＯ引物與常規(guī)引物特異性比較

對(duì)常規(guī)引物和ＤＰＯ引物的特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。ＤＰＯ引物僅在單增李斯特菌擴(kuò)增出目的條帶，而常規(guī)引物在大腸桿菌（肉中提?。⑼柺侠钏固鼐退问现举R氏菌中均有非特異性條帶出現(xiàn)。因此，ＤＰＯ引物的特異性要強(qiáng)于常規(guī)引物。

２．３ＤＰＯ引物與常規(guī)引物靈敏度的比較

ＬＢ瓊脂平板計(jì)數(shù)法測(cè)得單增李斯特菌的菌體濃度約為１０８ CFU／ｍＬ。將菌液稀釋，分別用常規(guī)和ＤＰＯ引物進(jìn)行３重ＰＣＲ擴(kuò)增。從圖9、圖10可以看出常規(guī)和ＤＰＯ引物擴(kuò)增單增李斯特菌的檢測(cè)靈敏度都為１０７ CFU／ｍＬ，沒(méi)有太大差別。ＤＰＯ多重PCR體系中菌體稀釋到１００倍以后就沒(méi)有條帶出現(xiàn)，并沒(méi)有表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，這可能與ＤＰＯ引物的結(jié)構(gòu)有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

３結(jié)論

ＤＰＯ引物具有特殊的結(jié)構(gòu)，引物自身以及引物之間很少形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，試驗(yàn)過(guò)程中不需要對(duì)引物進(jìn)行篩選，從而可以簡(jiǎn)化操作步驟［９］。ＤＰＯ引物特異性強(qiáng)，與模板發(fā)生錯(cuò)配的幾率很小，一旦有３個(gè)以上堿基錯(cuò)配，就不會(huì)成功擴(kuò)增［１０］。本研究中ＤＰＯ引物與常規(guī)引物相比，在退火溫度上沒(méi)有表現(xiàn)出很大的優(yōu)越性，但對(duì)Ｍｇ２＋濃度不敏感，在高Ｍｇ２＋濃度下還能保證擴(kuò)增特異性。

本研究建立的ＤＰＯ多重ＰＣＲ方法可在較短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地完成對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)。其與常規(guī)引物的對(duì)比表明ＤＰＯ引物具有很強(qiáng)的特異性，ＤＰＯ引物的應(yīng)用可以解決限制多重ＰＣＲ發(fā)展的非特異性問(wèn)題，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 徐偉，李素芳，劉軍． ＰＣＲ技術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌研究進(jìn)展［Ｊ］． 生物技術(shù)通報(bào)，２００８（１）：９５－９９.

［２］ 宋岱松．多重ＰＣＲ技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用［Ｊ］． 山東畜牧獸醫(yī)，２００９，３０（５）：５７－５８．

［３］ 韋兵， 劉永松，趙明． 食源性致病菌快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展［Ｊ］． 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００８，１２（２）：３－５．

［４］ ＣＨＵＮ Ｊ Ｙ，ＫＩＭ Ｋ Ｊ，ＨＷＡＮＧ Ｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，３５（６）：ｅ４０．

［５］ 陳偉，楊迎伍，鄧偉，等． ３種致病菌多重ＰＣＲ檢測(cè)體系的建立及應(yīng)用［Ｊ］． 食品與發(fā)酵工業(yè)，２００８，３４（９）：１３２－１３６．

［６］ 徐偉，劉軍，李素芳． 單增李斯特菌與志賀氏菌多重ＰＣＲ檢測(cè)技術(shù)的建立［Ｊ］． 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，２００９，９（１）：２０１－２０６．

［７］ 李盛豐，趙嬌，鐘名華，等．單增李斯特菌不同ＰＣＲ快速檢測(cè)方法比較［Ｊ］，中國(guó)公共衛(wèi)生，２００８，２４（８）：１０２１－１０２３．

［８］ 景建洲，趙培培，王博飛． 利用Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ檢測(cè)食源性致病志賀氏菌［Ｊ］. 食品科技，２０１０，３５（１）：２９３－２９６．

［９］ ＫＩＭ Ｊ Ｋ，ＬＥＥ Ｈ Ｊ，ＬＥＥ Ｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｍｕｔａｎｔｓ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｄｕａｌ－ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，１４９（１）：７６－８４．

［１０］ 劉梅，黃新，馬占鴻，等． 應(yīng)用ＤＰＯ引物檢測(cè)馬鈴薯病毒的多重ＲＴ－ＰＣＲ技術(shù)研究［Ｊ］． 植物病理學(xué)報(bào)，２００９，３９（４）：４３１－４４４．