陳 群，徐 平，王順旺，李 彬，張 麗，宋凱英

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563003;2.廈門市第三醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，福建 廈門 361100)

阿爾茨海默病是臨床較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，常見于老年前期和老年期的漸進(jìn)性大腦退行性疾病，也是老年性癡呆的一種主要類型。目前，對(duì)癡呆的防治尚無(wú)理想藥物，已有藥物主要為乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑，如他克林、多奈哌齊等。但療效有限且毒性較大而使臨床應(yīng)用受限。中醫(yī)藥防治該病方法多樣、療效滿意，已引起廣泛關(guān)注［1-2］。白藜蘆醇(Res)是一種植物抗毒素，主要存在于葡萄、虎杖、花生、藜蘆等植物中，近十幾年來(lái)人們對(duì)Res多方面的研究結(jié)果證實(shí)其具有許多重要的生理活性，如:抗氧化、抗癌、保護(hù)心血管系統(tǒng)、雌激素樣作用、延緩衰老、影響骨代謝等［3-4］。本文觀察了反式白藜蘆醇(Trans-resveratrol，TR)對(duì)β-淀粉樣肽(Aβ25-35)損傷大鼠的海馬周圍皮層神經(jīng)元的作用。

1 材料

TR(純度:98%)、DHT苦味酸、RNAiso Regent液、熒光液Green Supermix、caspase-8、caspase-9 優(yōu)化引物，廣州華拓生物有限公司;Aβ25-35(Amyloidβ-Protein Fragment 25-35，批號(hào) A4559)，Sigma公司。

SPF級(jí)SD雄性大白鼠，體重為300～350 g，第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物室提供，許可證號(hào)scxk(渝)2007-0005。

iCycler熒光定量PCR儀，美國(guó) BioRad公司;Mastercycler Gradient PCR儀，德國(guó)Eppendorf;TU1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析儀器有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 造模及分組

Aβ25-35用生理鹽水溶解制成1μg/μL溶液孵育12 h后使用。SPF級(jí)SD雄性大白鼠72只，Morris水迷宮訓(xùn)練3 d，成績(jī)穩(wěn)定后，剔除逃避潛伏期＜5 s和＞50 s的大鼠，合格的70只隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組;模型組;TR高、低劑量組和多奈哌齊對(duì)照組。除假手術(shù)組外，其他各組造模。大鼠稱重，用5%水合氯醛0.7mL/100 g腹腔注射麻醉后固定于雙臂腦立體定位儀上，局部頭頂去毛、消毒，正中矢狀位切口，將骨膜分離、剝除，確定前、后囟，并使之處于同一水平面上，取前囟為0點(diǎn)，切開后選擇雙側(cè)海馬旁回為注射靶區(qū)(前囟后3.0 mm，中線左右旁開2.2 mm，硬腦膜下2.8 mm)，定位后用顱鉆孔，分別將 Aβ25-35溶液5μL緩慢注入雙側(cè)海馬旁回［5］，每側(cè)注射結(jié)束后留針5 min，用牙托粉和502膠混合物封閉鉆孔［5］，縫合切口。假手術(shù)組給予等體積生理鹽水。

2.2 給藥

TR用生理鹽水溶解制成不同濃度的溶液，制模結(jié)束大鼠清醒后開始給藥。TR高、低劑量組分別給予TR 40，10mg/(kg·d)，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水，對(duì)照組給予多奈哌齊1.75mg/(kg·d)，灌胃給藥，共10d。

2.3 取材

在造模后第11天每組取大鼠7只經(jīng)10%水合氯醛(0.8mL/100 g)麻醉，斷頭取腦，置于冰水混合的人工腦脊液里［5］，用病理切片刀切取雙側(cè)海馬及周圍腦組織放入10%福爾馬林中固定24 h以上用于TUNEL檢測(cè)，判斷造模是否成功，以便及時(shí)補(bǔ)充模型鼠。大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能檢測(cè)結(jié)束后(約制模后第17天)，大鼠經(jīng)10%水合氯醛(0.8mL/100 g)麻醉，取腦，置于冰水混合的人工腦脊液里［6］，用病理切片刀切取一側(cè)海馬及周圍腦組織放入10%福爾馬林中固定24 h以上用于TUNEL檢測(cè)，切取另一側(cè)海馬及周圍腦組織放入加有RNA萃取液0.5mL的EP管中，－80℃速凍用于real time RTPCR檢測(cè)。

2.4 檢測(cè)法

2.4.1 TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬及周邊腦組織細(xì)胞凋亡情況 10%福爾馬林處理后用防脫載玻片制作石蠟切片病理標(biāo)本，脫蠟水化，PBS沖洗2次(3 min/次，下同)。在0.1%TrionX-100枸櫞酸鈉滲透液上(2～8℃)孵育8 min，PBS沖洗2次。擦干組織周圍水份，每片加TUNEL反應(yīng)液50μL(陰性對(duì)照2張片子不加TUNEL反應(yīng)液，只加Label solution 50μL)于濕化盒中37℃、避光孵育60 min，PBS沖洗3次。擦干組織周圍水份，避光條件下，在片子上滴1滴PBS放在熒光顯微鏡(400×)上看，每組看6個(gè)片，每張片看8個(gè)視野。按照Roche公司試劑盒說(shuō)明書操作，然后在高倍鏡下(400×)下計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，即每張片選取10個(gè)細(xì)胞數(shù)最多的不重疊高倍視野計(jì)算出每個(gè)視野中凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的百分比，計(jì)算8個(gè)視野的平均凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及平均凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(每組7個(gè)樣本切片)。

2.4.2 real time RT-PCR法檢測(cè)大鼠海馬及皮質(zhì)caspase-8、caspase-9的表達(dá) 按文獻(xiàn)［7］方法及試劑盒說(shuō)明書提取、純化RNA，測(cè)定RNA含量，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。與試劑盒說(shuō)明書不同的是所加入的引物。目的基因表達(dá)的相對(duì)定量法:以PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)(cycle threshold，Ct值)為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，依次計(jì)算下列數(shù)據(jù)，Ct值的平均值=(Ct1+Ct2+Ct3)/3(重復(fù)管);dCt=Ct值的平均值－中間值(相同檢測(cè)基因的不同樣品Ct值的平均值中居中的值，即中位數(shù));基因的表達(dá)=2－dCt。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 TR對(duì)大鼠海馬旁回神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

TR對(duì)大鼠海馬旁回神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響按照5組的不同情況，自試驗(yàn)中截圖，見圖1。

TUNEL染色檢測(cè)再灌注后觀察海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡水平。用原位凋亡專用試劑盒處理后，利用顯微鏡及圖像處理系統(tǒng)軟件計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。模型組大鼠海馬區(qū)可見散在的弱陽(yáng)性細(xì)胞，胞體較大，著色淺。7d后低劑量組的腦缺血模型組海馬區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，著色較深，多為胞漿著色。而高劑量組陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，但是卻變成淡色著色，說(shuō)明高劑量組的效果不如低劑量組的效果凋亡水平;假手術(shù)組和對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)胞體較大，著色淺，說(shuō)明凋亡效果不如高、低劑量組和模型組。

圖1 模型組(A)、低劑量組(B)、高劑量組(C)、假手術(shù)組(D)和對(duì)照組(E)細(xì)胞的凋亡顯示(圓圈、黑色標(biāo)注箭頭分別示五組模型組海馬的凋亡小體)Fig.1 Hippocampal apoptotic body of model group(A)，low dosage group(B)，high-dosage group(C)，sham group(D)and control groups(E)(An arrow shows hippocampal apoptotic body)

假手術(shù)組、模型組、低劑量組、高劑量組和對(duì)照組的凋亡率分別為4.64%，27.2%，16.7%，14.2%和9.12%。模型組凋亡率最高，其次是低劑量組，它們與假手術(shù)組比較均有極顯著差異(P＜0.01);高劑量組和對(duì)照組的凋亡率與假手術(shù)組比較也有顯著差異(P＜0.05)。

3.2 real time RT-PCR法檢測(cè)大鼠海馬及皮質(zhì)caspase-8、caspase-9 的表達(dá)

結(jié)果見表1。假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)組織切片中可見少量caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，腦缺血模型組在造模7d后海馬區(qū)caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多。模型組中caspase-8和caspase-9的表達(dá)最高，對(duì)照組次之，與假手術(shù)組比較均有極顯著差異(P＜0.01);高劑量和低劑量與假手術(shù)組相比，也有顯著差異(P＜0.05)。另外，低劑量組與高劑量組比較，也有顯著差異(P＜0.05)。

表1 caspase-8、caspase-9 mRNA在各組的表達(dá)(n=7，±s)Tab.1 The expression of caspase-8、caspase-9 mRNA in each group(n=7，±s)

表1 caspase-8、caspase-9 mRNA在各組的表達(dá)(n=7，±s)Tab.1 The expression of caspase-8、caspase-9 mRNA in each group(n=7，±s)

與假手術(shù)組比較:1 P＜0.01，2 P＜0.05;與高劑量組比較:3 P＜0.05Compared with sham group:1 P＜ 0.01，2P＜0.05;Compared with high-dosage group:3 P＜0.05

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4 討論

阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要有遺傳因素、炎癥免疫學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)、膽堿能學(xué)說(shuō)、鋁中毒學(xué)說(shuō)等。有一個(gè)共識(shí)正在逐漸形成:即β淀粉樣蛋白(Aβ)肽的生成和蓄積是阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。β-淀粉樣是神經(jīng)毒性物質(zhì)，有研究表明邊緣系統(tǒng)注射入Aβ25-35后會(huì)先表現(xiàn)為caspase激活，在細(xì)胞凋亡途徑中，caspase-8是關(guān)鍵的啟動(dòng)型caspase，caspase-8的活化是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一步，caspase-3是該途徑的最后執(zhí)行者，然后才有神經(jīng)元的損傷［8］。本實(shí)驗(yàn)用TUNEL法檢測(cè)大鼠海馬及周邊腦組織細(xì)胞凋亡情況，模型組與其他各組有差異(P＜0.01)，進(jìn)一步說(shuō)明造模成功。PCR檢測(cè)的caspase-8和caspase-9的mRNA的表達(dá)結(jié)果進(jìn)一步表明，TR對(duì)Aβ25-35引起的腦細(xì)胞的炎癥及凋亡反應(yīng)有抑制作用，說(shuō)明TR對(duì)Aβ25-35損傷模型老鼠可能有部分保護(hù)作用，其機(jī)制可能是抑制Aβ25-35引起的炎癥反應(yīng)，下調(diào)caspases-8、caspases-9mRNA的表達(dá)，從而減輕神經(jīng)元的損傷。對(duì)于TR作用的量效關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

在本實(shí)驗(yàn)研究過程中發(fā)現(xiàn)損傷海馬旁回后，部分大鼠出現(xiàn)精神分裂癥的類似癥狀。相關(guān)資料表明，海馬旁回失活后可出現(xiàn)精神分裂癥幻聽等［9］。功能分區(qū)研究也表明，海馬旁回在高度復(fù)雜的記憶場(chǎng)景中起關(guān)鍵作用［10］，邊緣系統(tǒng)(包括海馬，海馬旁回)異常與大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有關(guān)，可能有助于精神分裂癥和暴力行為的神經(jīng)心理障礙研究，該研究可能成為進(jìn)一步查明暴力行為的神經(jīng)生物化學(xué)基礎(chǔ)［11］。TR是否可以成為治療精神分裂癥的新藥物，還有待進(jìn)一步研究。但是它的可能性也為我們今后在探索治療精神分裂癥方面提供了新的思路。

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