劉良專 游曉星 徐磊 吳移謀

肺炎嗜衣原體Pmp21蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建

劉良專 游曉星 徐磊 吳移謀

目的 PCR擴(kuò)增肺炎嗜衣原體多形態(tài)膜蛋白Pmp21基因，構(gòu)建pGEX-6p-2／Pmp21原核表達(dá)載體。方法 篩選Pmp21優(yōu)勢(shì)抗原表位，PCR法擴(kuò)增Pmp21目的基因；并亞克隆至pGEX6p-2原核表達(dá)載體；經(jīng)PCR與測(cè)序鑒定。結(jié)果 軟件分析選擇Pmp21優(yōu)勢(shì)抗原表位編碼基因的154bp～885bp位堿基序列，設(shè)計(jì)引物PCR法擴(kuò)增得到目的片段；構(gòu)建重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定， BLAST比對(duì)與Genbank上登錄序列完全一致。結(jié)論 成功構(gòu)建pGEX-6p-2／Pmp21載體，為研究Pmp21在Cpn感染中的作用奠定基礎(chǔ)。

肺炎嗜衣原體；Pmp21；載體

肺炎嗜衣原體多形態(tài)膜蛋白（polymorphic membrane proteins,Pmp）的發(fā)現(xiàn)是衣原體全基因序列分析的重大成果[1]。發(fā)現(xiàn)Cpn有21個(gè)基因編碼Pmp1～Pmp21[2-4]，其中PmpD (Pmp21)引起了人們的廣泛重視[5]。為此，本研究克隆Pmp21優(yōu)勢(shì)抗原表位，為探討其在Cpn感染中的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體 Cpn AR39株、pGEX-6p-2載體南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所保存。

1.1.2 主要試劑與試驗(yàn)動(dòng)物 限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶均為MBI產(chǎn)品、 DNA標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)MBI公司。

1.2 方法

1.2.1 Pmp6和Pmp21基因序列的獲取 登陸互聯(lián)網(wǎng)登陸（http://stdgen.northwestern.edu/），獲取Pmp21堿基序列，其Gene ID為Cpn0963。

1.2.2 Pmp21蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位的預(yù)測(cè) 登陸互聯(lián)網(wǎng)登陸http://www.expasy.org/tools/protscale.html,輸入Pmp21的核苷酸序列，篩選Pmp21優(yōu)勢(shì)抗原表位。

1.2.3 原核表達(dá)載體pGEX-6p-2/ Pmp21的構(gòu)建與鑒定 prime 5設(shè)計(jì) PCR引物， P1 序列為 5’-CGC GGATCC TCTGCTCATGTTGAAGAGGC -3’， P2序列為5’- TTTTCCTTTT GCGGCCGC CACAATGGGTCACAACAATG-3’，引入 BamHI和 NotI 酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 3min預(yù)變性，95℃45s， 53℃ 30s，72℃2.5min，循環(huán)28次，72℃延伸8min 終止反應(yīng)， 產(chǎn)物經(jīng) 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳分析，純化后克隆到pGEX-6p-2上，并轉(zhuǎn)化入E.coli BL21中，經(jīng)PCR篩選和測(cè)序（上海生工公司)鑒定。

2 結(jié)果

2.1 Pmp6、Pmp21優(yōu)勢(shì)抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果

經(jīng)Expasy軟件分析Pmp21基因的抗原表位結(jié)果顯示，其整個(gè)分子抗原性均較強(qiáng)，存在多個(gè)強(qiáng)抗原表位，其親水性和可及性參數(shù)結(jié)果如圖1、圖2。

圖1 親水性分析

圖2 可及性分析

2.2 Pmp21編碼基因的PCR擴(kuò)增

以重組質(zhì)粒及Cpn AR-39株全基因組DNA為模板，PCR分別擴(kuò)增Pmp21基因片段，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出特異性目的基因與預(yù)期片段大小一致（圖3）。

圖3 PCR擴(kuò)增Pmp6、Pmp21PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖電泳分析(1) 陰性對(duì)照； (2)陽(yáng)性對(duì)照(756bp）； (3)DNA marker；(4) Pmp21 PCR 產(chǎn)物 (732bp）； (5)PCR鑒定產(chǎn)物

2.3 基因測(cè)序結(jié)果與Blast分析

將原核表達(dá)載體進(jìn)行測(cè)序鑒定，并用Blast軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank上登陸的目的序列進(jìn)行比較分析，表明擴(kuò)增的目的基因序列與GenBank公布的基因序列相同，且密碼子讀碼框無(wú)移位。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)表明選用的Pmp蛋白有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性和抗原性，且軟件分析存在多個(gè)抗原優(yōu)勢(shì)表位；我們選取的基因片段高度保守，并與其他已知基因同源性低，在以后的實(shí)驗(yàn)中可以避免抗原之間的交叉反應(yīng)，從而有利于提高實(shí)驗(yàn)方法的特異性和靈敏性；目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)這種蛋白在Cpn感染中的應(yīng)用研究報(bào)道[6]。為此，本研究克隆Pmp21優(yōu)勢(shì)抗原表位，為探討其在Cpn 感染中的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究中所使用的克隆和表達(dá)載體pGEX-6P-2，其多克隆酶切位點(diǎn)含有BamHI/NotI，檢索發(fā)現(xiàn)在本研究預(yù)測(cè)基因的完整序列中沒(méi)有該酶切位點(diǎn)，從而選用該組限制性內(nèi)切酶作為該基因克隆的工具酶。此外，由于使用該載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化表達(dá)后的蛋白為GST融合蛋白，這為進(jìn)一步分離純化目的蛋白提供了依據(jù)。我們依據(jù)基因庫(kù)提供的基因序列設(shè)計(jì)引物，且選擇了雙酶切方法，能使目的基因定向插入到pGEX-6P-2載體上。并使用不同的方法對(duì)重組體進(jìn)行鑒定：起初通過(guò)PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)化后在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌克隆進(jìn)行初步篩選，篩選到陽(yáng)性克隆。再對(duì)篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)一步培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序鑒定，并與基因庫(kù)提供的基因序列進(jìn)行比對(duì)，最后進(jìn)一步證實(shí)克隆到載體中目的基因序列的正確性，為該蛋白的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] Tanzer RJ, Longbottom D, Hatch TP, et al. Identification of polymorphic membrane proteins of Chlamydia psittaci 6BC[J]. Infect Immun, 2001,69(4):2428-2434.

[2] Grimwood J,Stephens RS. Computational analysis of the polymorphic membrane protein superfamily of Chlamydia trachomatis and Chlamydia pneumoniae[J]. Microb Comp Genomics ,1999,4(3):187-201.

[3] Campbell LA, Kuo CC, Grayston JT. Structural and antigenic analysis of Chlamydia pneumoniae[J]. Infect Immun,1990 , 58(1): 93-97.

[4] Vandahl BB, Pedersen AS, Gevaert K, et al. The expression, processing and localization of polymorphic membrane proteins in Chlamydia pneumoniae strain CWL029[J]. BMC Microbiol,2002,36(9):1-12.

[5] Maria SC, Luca B, Maurizio C，et al. Identification of immunoreactive proteins of Chlamydia trachomatis by western blot analysis of a two-dimensional electrophoresis map with patient sera[J]. Electrophoresis，1999,20(11):2269-2279.

[6] Sharma J, Zhong Y, Dong F, et al. Profiling of human antibody responses to Chlamydia trachomatis urogenital tract infection using microplates arrayed with 156 chlamydial fusion proteins[J]. Infect Immun, 2006,74(3):1490-1409.

10.3969/j.issn.1009-4393.2011.36.026

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(No. 30870134/ c010902)

421001 南華大學(xué)病原生物研究所 （劉良專 游曉星 徐磊吳移謀）

吳移謀 E-mail:yimouwu@sina.com.cn