張麗芳 黃海建 陳建偉 王旭洲 宋嶼娜 李華良

我們利用胸、腹腔積液制作成細(xì)胞塊，并進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)檢測(cè)，效果良好，介紹如下。

1 資料和方法

1.1 病例來(lái)源

收集2010年～2011年在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院臨床送檢的胸、腹腔積液細(xì)胞學(xué)腫瘤陽(yáng)性病例11例，其中肺腺癌7例，肺大細(xì)胞癌1例，卵巢癌3例。所有病例均制作細(xì)胞塊，行HE、免疫化學(xué) CEA、Vimentin、TTF-1、CK5/6、Ki-67、CKH、CKL、Calretinin、CD56、Syn、CgA染色，8例肺癌病例行RT-PCR檢測(cè)。

1.2 試劑與儀器

EGFR外顯子19和21試劑盒購(gòu)于北京金菩嘉公司，采用Taqman探針技術(shù)檢測(cè)EGFR基因外顯子19 de1-E746-A750、del-L747-P753insS突變，以及外顯子21 L858R、L861Q的突變;石蠟標(biāo)本組織DNA提取試劑盒DEXPAT、Taq酶購(gòu)于寶生物大連公司;RT-PCR儀為美國(guó) ABI7500，基因擴(kuò)增 PCR儀為美國(guó)ABI9700;所有引物均由北京賽百盛公司提供。

1.3 細(xì)胞塊制作方法

將臨床送檢的胸、腹腔積液標(biāo)本在室溫下靜置10～20 min，用離心試管取容器底層標(biāo)本10～20 ml，2 000 r/min離心8～10 min，棄上清保留沉淀物［1］。在試管內(nèi)加入濃度為40 g/l的中性甲醛(10%中性福爾馬林)5～10 ml，與沉淀物混勻，室溫固定處理1 h，離心后棄上清，加入中性甲醛5～10 ml，混勻補(bǔ)充固定1 h后離心，棄上清，用濾紙包好沉淀物。若胸、腹腔積液中沉淀物少時(shí)，可再加入75%乙醇5～10 ml靜置30 min，使沉淀物凝固硬化，便于多收獲細(xì)胞和取材打包。經(jīng)常規(guī)脫水和石蠟包埋，作4 μm厚切片，每個(gè)病例連續(xù)切片3張，分別行HE、免疫組化染色及PCR檢測(cè)。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法

①石蠟切片4 μm，貼附在預(yù)先涂有0.01%多聚賴(lài)氨酸的玻片上，60～62℃烤片3 h;② 二甲苯脫蠟5 min×3次，100%、95%、80%和60%酒精各5 min，自來(lái)水流洗5 min;③0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中高壓修復(fù)1～2 min，冷卻至室溫，水洗2 min，PBS(pH7.4)洗2 min×3次;④ 切片入3%H2O2水溶液10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗2 min×3次;⑤ 滴加工作濃度的第一抗體于37℃濕盒內(nèi)孵育1～2 h，PBS洗2 min×3次;⑥ 滴加聚合物增強(qiáng)劑(試劑A)，室溫孵育20 min，PBS洗2 min×3次;⑦滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫孵育30 min，PBS洗2 min×3次;⑧ AEC或DAB顯色，水洗2 min;⑨蘇木精復(fù)染1～2 min，中性樹(shù)膠封片。所用一抗及二抗 EliVisionTM plus試劑盒等均購(gòu)自福建邁新公司。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)

石蠟組織DNA提取采用TakaRa DEXPAT試劑盒。將3～5片10 μm厚的石蠟切片放于Eppendorf管中，加入DNA提取液10滴，充分混勻，100℃加熱10 min，13 000 r/mim 離心10 min，吸取其上清直接用于RT-PCR反應(yīng)。DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量，0.8%瓊脂糖電泳判定其質(zhì)量。肺癌患者組織中EGFR 19、21外顯子RT-PCR檢測(cè)操作方法嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色

肺腺癌的染色片中:腫瘤細(xì)胞排列呈腺樣、花環(huán)樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中等大小，胞質(zhì)淡染，可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)分泌物，細(xì)胞異型性明顯，核分裂像不易見(jiàn)。肺大細(xì)胞癌的染色片中:腫瘤細(xì)胞呈巢狀分布，細(xì)胞體積大，胞質(zhì)豐富略嗜伊紅，可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)分泌物，部分可見(jiàn)1個(gè)核仁，細(xì)胞異型性明顯。卵巢腺癌的染色片中:腫瘤細(xì)胞排列呈腺樣、乳頭狀及巢狀等結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中等大小，胞質(zhì)嗜堿，可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)分泌物，細(xì)胞異型性明顯。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色及RT-PCR檢測(cè)

7例肺腺癌病例，腫瘤細(xì)胞均呈CEA、TTF-1、CKL強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，Ki-67增殖指數(shù)30% ～50%之間，免疫細(xì)胞化學(xué)染色陰性抗體有 CK5/6、CKH、Vimentin、Calretinin、CD56、Syn、CgA。肺大細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞呈 CEA、CKL強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，CKH、CD56、Syn、CgA灶性陽(yáng)性，Ki-67增殖指數(shù)50%，免疫細(xì)胞化學(xué)染色陰性抗體有CK5/6、Vimentin、Calretinin。3例卵巢腺癌的染色片中:腫瘤細(xì)胞呈CKL、CEA強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，Ki-67增殖指數(shù)45%，免疫細(xì)胞化學(xué)染色陰性抗體有 TTF-1、CK5/6、CKH、Vimentin、Calretinin、CD56、Syn、CgA(表 1)。

2.3 RT-PCR 結(jié)果

11例胸、腹腔積液細(xì)胞塊的EGFR的RT-PCR檢測(cè)顯示，第2例細(xì)胞塊標(biāo)本檢出EGFR基因外顯子19 delE746-A750位點(diǎn)發(fā)生突變，其余病例均陰性。

表1 11例胸腹腔積液細(xì)胞塊免疫細(xì)胞化學(xué)染色及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

臨床送檢的胸腹腔積液中，部分為腫瘤性胸腹腔積液，若充分利用并將其制作細(xì)胞塊進(jìn)行石蠟切片，行HE染色、免疫組化和基因檢測(cè)等則可取得理想效果，為診斷和治療提供依據(jù)［2］。但腫瘤性胸腹腔積液中因含有大量紅細(xì)胞及多種蛋白質(zhì)，在制作細(xì)胞塊過(guò)程中，40 g/l中性甲醛能及時(shí)固定有核細(xì)胞，所以收獲腫瘤細(xì)胞更多;同時(shí)經(jīng)甲醛溶液多次洗滌可去除其中的紅細(xì)胞和內(nèi)源性蛋白質(zhì)，防止免疫細(xì)胞化學(xué)非特異性染色。

細(xì)胞塊石蠟包埋HE染色切片中，細(xì)胞呈單層平鋪狀排列，結(jié)構(gòu)清晰易于辨認(rèn);其次背景清晰，有診斷價(jià)值的信息更多，另外細(xì)胞塊能連續(xù)切片，用于免疫細(xì)胞化學(xué)和基因突變檢測(cè);蠟塊可存檔，有利于回顧性研究。

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是在細(xì)胞學(xué)的基礎(chǔ)之上進(jìn)行的，具有以下優(yōu)點(diǎn):細(xì)胞塊石蠟包埋切片能最大限度暴露和修復(fù)細(xì)胞內(nèi)抗原，有利于抗原抗體結(jié)合，增加免疫細(xì)胞化學(xué)染色的敏感性;有診斷價(jià)值的細(xì)胞集中，行免疫細(xì)胞化學(xué)時(shí)可節(jié)約試劑量;組織塊可連續(xù)切片做多項(xiàng)染色，進(jìn)行診斷或研究;細(xì)胞著色充分均勻，防止假陽(yáng)性結(jié)果。

RT-PCR檢測(cè)可以定性和定量。利用RT-PCR檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的EGFR基因突變情況，可指導(dǎo)臨床靶向治療［3］。RT-PCR具有以下優(yōu)點(diǎn):RT-PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作，支持靶向治療;特異性好，準(zhǔn)確性高，靈敏度高;操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高和防污染。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著.臨床技術(shù)操作規(guī)范(病理學(xué)分冊(cè))〔M〕.第1版.北京:人民軍醫(yī)出版社，2004:42.

［2］尹艷華，李玉紅，張 杰.胸腔積液細(xì)胞學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)在鑒別肺轉(zhuǎn)移性腺癌和問(wèn)皮細(xì)胞中的臨床價(jià)值分析〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，9(15):1253.

［3］李永文，劉紅雨，李穎王，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR和測(cè)序法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變的比較〔J〕.中國(guó)肺癌雜志，2009，12(12):1255.