賀宗毅，吳天祥

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

天麻對灰樹花液體深層發(fā)酵的影響

賀宗毅，吳天祥*

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

研究中藥天麻對灰樹花液體深層發(fā)酵的影響，應(yīng)用Minitab15軟件設(shè)計了Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)，篩選出葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、天麻濃度、無機(jī)鹽配比4個顯著性影響因素，通過正交實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明天麻對灰樹花液體深層發(fā)酵的最佳工藝條件為：葡萄糖質(zhì)量濃度30g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度5.5g/L，天麻質(zhì)量濃度7g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度1.5g/L，MgSO4質(zhì)量濃度0.75g/L。每升發(fā)酵液中可得到灰樹花胞外多糖為3.91g，與不添加天麻的對照組相比，胞外多糖產(chǎn)量提高了3.4%。

灰樹花，天麻，胞外多糖，發(fā)酵

灰樹花（Polyporus frondosus），又名栗子蘑、栗蘑、千佛菌、貝葉多孔菌、甜瓜板、舞茸等，屬于真菌門（Eumycota）、擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）、多孔菌屬（Polyporus）的一種大型真菌［1］?；覙浠ㄊ且环N富含多糖、維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽等有效成分的藥、食兩用菌［2］。灰樹花性平味甘，在藥用價值方面可用來治療小便不利、水腫、腳氣、肝硬化、腹水、糖尿病及高血壓、肥胖等疾病。近年來的研究表明，灰樹花中富含的多糖類物質(zhì)具有明顯的抗誘變、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫［3］、抑制腫瘤［4-5］、抗HIV、保肝護(hù)肝等生理活性作用［6-8］。天麻（Rhizoma Gastrodiae）［9］為蘭科多年生寄生菌植物，以蜜環(huán)菌的菌絲或菌絲分泌物為營養(yǎng)來源。天麻主要產(chǎn)于四川、云南、貴州，其干燥塊莖富含天麻素，可以入藥，具有平肝、息風(fēng)、止痙的作用，主治頭痛眩暈、肢體麻木、小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐等癥。近幾年研究表明，向真菌培養(yǎng)基中添加適量的中藥可以促進(jìn)真菌的生長或提高活性產(chǎn)物的產(chǎn)量［10-11］。本實(shí)驗(yàn)利用灰樹花向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了適量的天麻，以胞外多糖產(chǎn)量和菌絲量為考察指標(biāo)，并用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹花（51616） 購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；天麻 購于貴陽市藥房；斜面種子培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基［12］；液體種子培養(yǎng)基 葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖2%，蛋白胨0.4%，天麻0.5%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%；KH2PO4汕頭市金矽化工廠；MgSO4浙江省明礬石精細(xì)化工廠；蛋白胨浙江海川化學(xué)品有限公司；葡萄糖 汕頭市西隴化工廠；無水乙醇 成都金山化學(xué)試劑有限公司。

722型可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；高速離心機(jī)TDL-40B 上海安亭科學(xué)儀器廠；凈化工作臺SW-CJ-1D 蘇州凈化設(shè)備有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱GZX-9070、生化培養(yǎng)SPX-150B-Z、高壓滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司設(shè)備廠；電冰箱 合肥榮事達(dá)電冰箱有限公司；分析天平AUY120島津國際貿(mào)易公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斜面種子培養(yǎng) 于母種試管中切取出黃豆粒大小的菌絲塊，接種于斜面中部，25℃恒溫培養(yǎng)9d。

1.2.2 液體種子培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的斜面菌種切取蠶豆大小，接種于液體培養(yǎng)基中，250mL三角瓶裝液量100mL，25℃，150r/min，搖床培養(yǎng)9d。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 按10%的接種量取液體種子進(jìn)行接種，250mL三角瓶裝液量 100mL，25℃，150r/min，搖床培養(yǎng)8d。

1.2.4 生物量計算 將發(fā)酵液離心（4000r/min，20min），用蒸餾水沖洗菌絲濾餅兩次，再離心，菌絲在90℃電熱恒溫干燥箱中烘干至恒重，稱重得菌絲生物量。

1.2.5 胞外多糖含量測定 將 100mL發(fā)酵液經(jīng)4000r/min離心20min，得到的濾液用3，5-二硝基水楊酸比色法［13］測還原糖含量、苯酚-硫酸法［14］測總糖含量。胞外多糖含量等于總糖含量與還原糖含量之差。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 碳源的確定 選擇葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉分別作為灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，質(zhì)量濃度為3%，以空白組作為對照，其它條件不變。發(fā)酵完成后分別測定菌絲生物量及胞外多糖產(chǎn)量，以考察不同碳源對灰樹花生長的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 不同碳源對灰樹花深層發(fā)酵的影響

碳源是灰樹花能量代謝的來源，不同種類的碳源對其發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響差異顯著，由圖1可以得出，灰樹花能夠比較好地利用麥芽糖和葡萄糖，但是以葡萄糖作為碳源時胞外多糖產(chǎn)量最高，質(zhì)量濃度為2.21g/L，菌體生物量也最高，故選葡萄糖作為碳源。

2.1.2 氮源的確定 以葡萄糖為碳源，分別選擇蛋白胨、尿素、酵母膏、硫酸銨、磷酸二氫銨作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，質(zhì)量濃度為0.4%，以空白組作為對照，其它條件不變。發(fā)酵完成后分別測定菌絲生物量及胞外多糖產(chǎn)量，考察不同氮源對灰樹花生長的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

氮是灰樹花生長過程中不可缺少的元素，研究了上述5種氮源，從圖2中可得出，灰樹花對有機(jī)氮源的利用優(yōu)于無機(jī)氮源（尿素除外），其中又以蛋白胨為最佳，所以選擇蛋白胨為氮源。

圖2 不同氮源對灰樹花深層發(fā)酵的影響

2.1.3 碳源質(zhì)量濃度對菌體生長的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度的葡萄糖，其它條件不變，發(fā)酵完成后研究其對胞外多糖及菌絲生物量的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 葡萄糖添加量對灰樹花深層發(fā)酵的影響

由圖3可得出，在一定的葡萄糖濃度范圍內(nèi)，胞外多糖產(chǎn)量和菌體干重隨著葡萄糖濃度的增大而增大。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為30g/L時，胞外多糖和菌體干重達(dá)到最大值；當(dāng)葡萄糖濃度超過30g/L時，胞外多糖產(chǎn)量和菌體干重都呈下降趨勢，故選擇葡萄糖質(zhì)量濃度為30g/L。

2.1.4 氮源質(zhì)量濃度對菌體生長的影響 向發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度的蛋白胨，其它條件不變，研究其對胞外多糖及菌絲生物量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 蛋白胨添加量對灰樹花深層發(fā)酵的影響

由圖4可以看出，隨著蛋白胨質(zhì)量濃度的增加，灰樹花生長旺盛，菌體干重及胞外多糖產(chǎn)量增加。當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為6g/L時，菌體干重達(dá)到最大值，此時胞外多糖產(chǎn)量亦達(dá)到最大值，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度超過6g/L時，灰樹花菌體干重及胞外多糖產(chǎn)量均趨于平穩(wěn)，說明6g/L的蛋白胨能夠滿足灰樹花的生長，所以選擇蛋白胨質(zhì)量濃度為6g/L。

2.1.5 無機(jī)鹽配比對灰樹花發(fā)酵的影響 藥用真菌的生長離不開各種無機(jī)離子，其中P、K、Mg等元素為真菌生長所必需。在其它條件不變的情況下，將KH2PO4∶MgSO4按質(zhì)量比為2∶1的比例添加進(jìn)行合并考察，結(jié)果見圖5。

圖5 不同無機(jī)鹽配比對灰樹花深層發(fā)酵的影響

由圖5可知，當(dāng)KH2PO4和MgSO4的質(zhì)量濃度分別為2g/L和1g/L時，灰樹花發(fā)酵最好，此時胞外多糖含量及菌體干重分別為3.12g/L和8.6g/L。

2.1.6 天麻質(zhì)量濃度對菌體生長的影響 灰樹花是藥食兩用真菌，在搖瓶培養(yǎng)基中加入適量的天麻，利用灰樹花強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化能力，對天麻中的纖維、糖類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)加以利用?；覙浠ㄔ谏L代謝過程中可以對天麻中的主要成分天麻素進(jìn)行轉(zhuǎn)化利用，從而提高胞外多糖的產(chǎn)量。在其它條件不變的情況下，不同質(zhì)量濃度的天麻添加量對灰樹花發(fā)酵的影響結(jié)果見圖6。

圖6 天麻添加量對灰樹花深層發(fā)酵的影響

從圖6中可以看出，天麻的添加量對灰樹花胞外多糖的產(chǎn)生具有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)天麻質(zhì)量濃度為7g/L時，胞外多糖產(chǎn)量及菌體干重均達(dá)到最大值，但隨著天麻質(zhì)量濃度的升高，灰樹花菌體生物量隨之降低。可能是天麻中的某些成分對灰樹花菌絲的生長產(chǎn)生了抑制作用，所以選擇天麻質(zhì)量濃度為7g/L。

2.1.7 培養(yǎng)時間對灰樹花發(fā)酵的影響 在實(shí)驗(yàn)過程中選擇1～11d為發(fā)酵周期，在其它條件不變的情況下，考察其對灰樹花發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 培養(yǎng)時間對灰樹花深層發(fā)酵的影響

由圖7可知，第9d時灰樹花產(chǎn)胞外多糖和菌體干重達(dá)到最大值，此后隨著時間的延長，胞外多糖產(chǎn)量及菌體生物量趨近于平穩(wěn)，所以選擇9d作為發(fā)酵培養(yǎng)時間。

2.2 Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)

根據(jù)碳源、氮源濃度、無機(jī)鹽元素配比、天麻濃度、培養(yǎng)時間的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計 n=12的Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)，每個因子取高（ +1）、低（-1）2個水平，發(fā)酵完成后以發(fā)酵液中胞外多糖的產(chǎn)量為響應(yīng)值Y。參數(shù)和水平設(shè)計見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，各因素的效應(yīng)評價及系數(shù)估計見表3。P＜0.05說明該因素是顯著的，可對該因素作進(jìn)一步的考察。從表3可得，葡萄糖質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度、無機(jī)鹽配比和天麻質(zhì)量濃度對灰樹花深層發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖具有顯著性影響。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計參數(shù)和水平

表2 Plackett-Burman設(shè)計矩陣及結(jié)果

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計結(jié)果分析

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、天麻濃度及無機(jī)鹽配比4個因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。根據(jù)單因素中4個因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取各因素的最優(yōu)值作為中間水平，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。各因素選取水平情況見表4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見表5。

表4 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，葡萄糖質(zhì)量濃度是灰樹花深層發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的最顯著因素，其余三種因素的顯著性影響程度依次是蛋白胨、無機(jī)鹽配比、天麻質(zhì)量濃度。從表5可知，四因素的最佳組合為：A′1B′2C′1D′2，即葡萄糖質(zhì)量濃度30g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度5.5g/L，天麻濃度7g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度1.5g/ L，MgSO4質(zhì)量濃度0.75g/L。按最佳發(fā)酵條件，分成A、B兩組進(jìn)行灰樹花液體深層發(fā)酵，B組為不添加天麻的對照組。9d后測得A組胞外多糖質(zhì)量濃度平均值為3.91g/L，B組的平均值為3.78g/L。與對照組相比A組胞外多糖產(chǎn)量提高了3.4%。

3 結(jié)論

通過在灰樹花深層發(fā)酵培養(yǎng)基中加入天麻的探索，得出添加天麻可提高灰樹花產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量。并通過Plackett-Burman篩選和正交實(shí)驗(yàn)，確定了添加天麻后的最佳發(fā)酵工藝條件：葡萄糖質(zhì)量濃度30g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度 5.5g/L，天麻濃度 7g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度1.5g/L，MgSO4質(zhì)量濃度0.75g/L，培養(yǎng)9d，此時胞外多糖含量可達(dá)3.91g/L，與對照組相比胞外多糖產(chǎn)量提高了3.4%。實(shí)驗(yàn)表明，添加適量的天麻到灰樹花發(fā)酵液中可促進(jìn)其胞外多糖的產(chǎn)生，為今后進(jìn)一步研究如何提高灰樹花產(chǎn)胞外多糖奠定基礎(chǔ)。

［1］張松.食用菌學(xué)［M］.廣州：華南理工大學(xué)出版社，2000：23-25.

［2］莊毅.中國藥用真菌概況［J］.中國食用菌，2001，20（2）：3-5.

［3］MatsuiK，Kodama N，Nanba H.Effectsofmaitake（Grifolafrondosa）D-fraction on the carcinoma angiogenesis［J］.Cancer Letters，2001，172：193.

［4］Ohno N，Iino K，Takeyama T，et al.Study on fermentartion conditions of Grifolafrondosa［J］.Chem Pharma Bull，1984，32（3）：1142.

［5］Nanba H.Maitake mushroom immumotherapy to prevent from cancer growth and metastasls［J］.1995（6）：1.

［6］鄧超，鄔敏辰.食用菌深層發(fā)酵及其多糖活性研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（15）：4622-4625.

［7］周鵬，謝明勇.多糖的生物活性［J］.食品研究與開發(fā)，2001，22（2）：6-8.

［8］陳士良.藥用真菌灰樹花深層發(fā)酵技術(shù)及其抗腫瘤多糖的研究［D］.無錫輕工大學(xué)博士學(xué)位論文，2000.

［9］謝宗萬.中藥材品種論述（上冊）［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1990：367-368.

［10］楊海龍，吳天祥，章克昌.中藥提取液對靈芝深層發(fā)酵的影響［J］.微生物學(xué)報，2003（4）：519-522.

［11］王興紅，李旗德，曹秋娥.微生物發(fā)酵中藥應(yīng)成為中藥研究的新內(nèi)容［J］.中草藥，2001，32（3）：267-268.

［12］周德慶.微生物學(xué)教程［M］.北京：高等教育出版社，1993：38-44.

［13］王叔淳.食品衛(wèi)生檢驗(yàn)技術(shù)手冊［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002：131-133.

［14］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：10-12.

Effects of Rhizoma gastrodiae on the submerged fermentation of Polyporus frondosus

HE Zong-yi，WU Tian-xiang*
（School of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

The effects of Rhizoma gastrodiae on Polyporus frondosus in submerged were studied.The concentration of glucose，peptone and Rhizoma gastrodiae，and mineral salt ratio were confirmed as the four important factors by plackett-burman experiment.Then，the four important factors were optimized by orthogonal experiment design.The results showed that under the conditions of glucose 30g/L，peptone 5.5g/L，Rhizoma gastrodiae 7g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO40.75g/L，the yield of exopolysaccharide reached 3.91g/L，the production of exopolysaccharide increased by 3.4%compared with control group.

Polyporus frondosus；Rhizoma Gastrodiae；exopolysaccharide；culture

TS201.1

B

1002-0306（2011）01-0184-04

2010-07-21 *通訊聯(lián)系人

賀宗毅（1986-），男，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物。

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長資金項(xiàng)目［黔省專合字（2009）106號］。