閔玉濤，宋彥顯，徐鳳才，馬慶一，*

（1.中州大學(xué)，河南鄭州450044；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院，河南鄭州450002）

豬胰臟淀粉酶的提取、部分純化與性質(zhì)研究

閔玉濤1，宋彥顯1，徐鳳才2，馬慶一2，*

（1.中州大學(xué)，河南鄭州450044；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院，河南鄭州450002）

以豬胰臟為原料，采用異丙醇沉淀、硫酸銨鹽溶鹽析、透析和反滲透系列方法對淀粉酶提取純化，并對其性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，制備的反滲透酶比活力達(dá)856U/mg，約為粗酶（146U/mg）的6倍，可替代市購粗淀粉酶用于實驗，其最適溫度和pH分別為37℃和6.9。

豬胰淀粉酶，鹽溶鹽析，透析，反滲透，比活力

我們的系列研究工作涉及到在一個模擬的人工胃腸中探討α-淀粉酶催化的第一步淀粉消化過程，實驗中需要大量的淀粉酶。目前，微生物發(fā)酵產(chǎn)酶是α-淀粉酶的主要來源，廉價的發(fā)酵法所生產(chǎn)的淀粉酶可以很容易地從市場上獲取。但我們遭遇到事先未預(yù)料到的困難：市售的粗酶含有大量的糖類，從而對實驗中用做分析跟蹤的硫酸苯酚測糖法造成嚴(yán)重干擾。從動物原料提取α-淀粉酶是一種傳統(tǒng)的制備方法。利用該法所得到的酶與微生物源酶在最適作用溫度、pH、抑制劑等方面有一定差異。盡管微生物發(fā)酵法頗具優(yōu)勢，后來居上已成為生產(chǎn)淀粉酶的主要方法，但傳統(tǒng)的提取法仍然應(yīng)用于某些場合，例如在研究人體生理和藥物的制備等科研工作中。哺乳動物提取酶由于與人體酶更相近，因而更適合采用。例如豬胰淀粉酶和人體內(nèi)的淀粉酶一樣都是α-淀粉酶，其分子量均約為46kD，最適pH6.7～7.0。目前，我國動物來源的胰α-淀粉酶主要從國外進(jìn)口，價格昂貴，且到貨周期長，給科研工作帶來極大的不便。豬胰臟來源廣泛，且由于口感不佳，在屠宰場經(jīng)常被遺棄，價格低廉。從豬胰臟中提取α-淀粉酶在國內(nèi)還鮮有報道，本文研究了從豬胰臟中提取α -淀粉酶，初步純化以及酶的性質(zhì)等。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮豬胰臟 鄭州鄭榮屠宰場；所用試劑 均為國產(chǎn)分析純。

J-25立式高速低溫離心機(jī)（BECKMANCOULTER），UV754紫外分光光度計，磁力攪拌器，低溫層析柜，新飛BCD-245D冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 相關(guān)試劑的配制

1.2.1.1 3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑的配制［1］精確稱取3，5-二硝基水楊酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100mL。

1.2.1.2 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將麥芽糖放置在烘箱中80℃烘干，準(zhǔn)確稱取0.050g，加入蒸餾水，定容至50mL，配制成1000μg/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.1.3 1%可溶性淀粉溶液的配制 精確稱取可溶性淀粉1.0g于小燒杯中，加入40mL蒸餾水，在電爐上加熱至溶液透明，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用蒸餾水反復(fù)洗滌燒杯，一并轉(zhuǎn)移至容量瓶中，定容至100mL。

1.2.2 豬胰臟α-淀粉酶的提取、部分純化

1.2.2.1 豬胰臟 α-淀粉酶的提取［2］取新鮮豬胰臟，去除雜質(zhì)后取100g，在絞肉機(jī)中攪碎成漿，加入160mL 7.5%異丙醇（磷酸鹽緩沖液配成），1gCaCl2，4℃下提取4h，再在4℃下5000r/min離心20min，上清液為粗酶液（酶①145mL）。

1.2.2.2 豬胰臟α-淀粉酶的部分純化 部分純化流程如圖1所示。

圖1 酶部分純化流程示意圖

1.2.3 豬胰臟α-淀粉酶的活性測定

1.2.3.1 酶液中蛋白含量測定 取一定量的酶①、酶②、酶③及反滲透酶，經(jīng)適當(dāng)稀釋，在 260nm和280nm波長處分別測定其吸光度值，然后利用Lowry -Kalckar公式［3］計算蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.3.2 酶比活力的測定 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、100、200、400、600、800μL，分別放入不同試管中，用水補(bǔ)至1000μL，加1mL DNS，置于沸水浴中加熱4min顯色，冰水浴中靜置4min冷卻，定容至10mL，在分光光度計上于540nm下讀取吸光度值，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶比活力的測定：在6份600μL緩沖溶液中，分別加入200μL 1%的可溶性淀粉為底物，37℃恒溫水浴10min后，分別加入200μL酶①、酶②、酶③和反滲透酶稀釋液，用秒表開始準(zhǔn)確計時，4min后分別加入1mL DNS，沸水浴加熱5min顯色，冰水浴靜置5min冷卻，用水補(bǔ)至10mL，分別于分光光度計上在540nm下測定吸光度值。同時以不加酶的作空白對照實驗，以扣除可溶性淀粉中原有還原糖的干擾。根據(jù)麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線算出生成產(chǎn)物的量，并計算出酶反應(yīng)速度。酶活力定義：1%的可溶性淀粉為底物，pH6.9，溫度37℃下，每分鐘生成1μg麥芽糖所用的酶量為一個酶活力單位。

1.2.4 豬胰淀粉酶性質(zhì)研究

1.2.4.1 最適酶用量的確定［4］按表1中順序添加試劑及適當(dāng)稀釋酶液進(jìn)行測定。取5組（每組7個）試管和一定稀釋倍數(shù)的α-淀粉酶，用來測定反應(yīng)的初始速率。酶反應(yīng)開始后，準(zhǔn)確計時，每間隔1min，分別向每組中的一個試管內(nèi)加入1mL DNS終止反應(yīng)，將反應(yīng)液置沸水浴5min，迅速冷卻，加蒸餾水稀釋到10mL，在540nm處，以空白作對照，測定吸光度值。

表1 最適酶量的確定實驗

1.2.4.2 酶活與溫度的關(guān)系 以1%可溶性淀粉為底物（200μL），在pH 6.9的條件下，加入200μL的酶，在20、30、35、40、45、50、60℃下分別反應(yīng)5min后，加DNS終止反應(yīng)，顯色后，用水將體積補(bǔ)至10mL，在540nm處測定其吸光度，同時用不加酶的體系作對照。

1.2.4.3 酶活與pH的關(guān)系 在37℃酶及底物用量均為200μL的條件下，改變pH（5、5.5、6、6.5、7.0、7.5、8.0），其它操作同1.2.4.2。

2 結(jié)果與討論

2.1 豬胰臟α-淀粉酶的提取和部分純化

由于酶是生物活性物質(zhì)，高溫易變性失活，因此其提取全過程的溫度要控制在4℃以下，以保證酶具有足夠的活力。粗酶應(yīng)用有機(jī)溶劑沉淀法、硫酸銨鹽溶鹽析、透析和聚乙二醇反滲透的方法進(jìn)行不斷純化，得到比活力較高、貯藏時間長的反滲透酶液。利用酶蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，透析除去硫酸銨，從而得到提純的酶液。反滲透可以濃縮酶，提高其濃度，從而防止其失活，有利于酶的貯藏。

提取過程不能與金屬和玻璃制品接觸，以避免酶失活。在實驗過程中，酶稀釋液保藏于4℃的環(huán)境中，而且伴隨著酶的失活，其稀釋液要少量多次地配制，并經(jīng)常檢測酶的活力。

2.2 豬胰臟α-淀粉酶活性測定

2.2.1 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)方程為：

y=0.0012x-0.0279（R2=0.998）。

圖2 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 酶液中蛋白含量測定 Lowry-Kalckar公式計算結(jié)果如表2所示。

表2 不同類型酶液蛋白質(zhì)含量

2.2.3 透析酶比活力的比較 對同一種酶來說，比活力越高，表明酶越純。為檢測純化后酶的活性，對酶①、酶②、酶③以及反滲透酶的活力進(jìn)行了比較測定。酶①、酶②、酶③以及反滲透酶分別稀釋100、200、2000、2500倍后催化淀粉的反應(yīng)，經(jīng)顯色后測得它們的A540分別為0.10、0.08、0.86、0.45，根據(jù)麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線算出生成產(chǎn)物的麥芽糖量分別為23.35、23.33、24.11、23.70μg。

由式（2）和式（3）計算酶的比活力大小，結(jié)果見表3。

表3 不同純度酶的比活力表

由表3可知，酶在純化過程中比活力越來越高，說明酶的純度在不斷提高。反滲透酶的比活力最高（856U/mg），是酶①（粗酶）比活力（146U/mg）的5.86倍。

2.3 酶性質(zhì)的研究

2.3.1 最適酶量的確定 不同量的 α-淀粉酶在7min內(nèi)的酶反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)程曲線如圖3所示。酶活力測定就是要使酶反應(yīng)的初速率（V0）達(dá)到最大速率Vm，即在過量底物存在下的零級反應(yīng)期的速率，此時反應(yīng)速率和酶濃度［E］之間有線性關(guān)系。確定用于動力學(xué)分析的最適酶量是重要的關(guān)鍵步驟，如果反應(yīng)液中酶量太少，在反應(yīng)一段時間后，吸光值將改變很少，以至于顯示底物濃度改變和抑制劑作用差異引起的變化很困難；另一方面，若是反應(yīng)中酶量太多，將使反應(yīng)進(jìn)程太快，由于底物迅速消失，時間歷程曲線趨向平坦，反應(yīng)達(dá)到平衡的時間過早出現(xiàn)，因此測不到產(chǎn)物生成量與酶反應(yīng)時間成線性關(guān)系的這一段時間內(nèi)的初速率，即得不到反應(yīng)速率和酶量成正比關(guān)系的結(jié)果。為避免這兩種極端情況的出現(xiàn)，必須使測定的反應(yīng)速率（以ΔA/min表示）的吸光度值在0.03～0.25/min之間［5］。

從圖3中可以看出，［E］越大，線性反應(yīng)期越短。比較不同酶量反應(yīng)進(jìn)程曲線方程的線性時間范圍，發(fā)現(xiàn)即使在酶量為250μL時的反應(yīng)進(jìn)程曲線，在4min內(nèi)也有較好的線性關(guān)系，這也說明所有酶量的酶反應(yīng)進(jìn)程曲線在4min反應(yīng)時間內(nèi)，皆有很好的線性關(guān)系，因此在4min內(nèi)測得的速率為反應(yīng)初始速率。比較反應(yīng)的初始速率后，選定酶量為200μL，反應(yīng)時間4min進(jìn)行動力學(xué)常數(shù)的測定。

2.3.2 溫度與酶活性的關(guān)系 由圖4可知，α-淀粉酶在不同溫度下的活力不同，在35～40℃溫度范圍內(nèi)保持較高的活力，其最適溫度為37℃。當(dāng)溫度高于和低于37℃時，酶活力都變小。這是由于在酶反應(yīng)的最初階段，酶蛋白的變性尚未表現(xiàn)出來，因此反應(yīng)速率隨溫度升高而增加，但高于最適溫度37℃時，酶蛋白變性逐漸突出，反應(yīng)速率隨溫度升高的效應(yīng)將逐漸為酶蛋白變性效應(yīng)所抵消，反應(yīng)速率迅速下降。值得注意的是：最適反應(yīng)溫度并非常數(shù)，在不同底物濃度、不同pH、不同反應(yīng)時間的條件下，最適溫度也會有所差異。

圖3 不同酶量反應(yīng)進(jìn)程曲線

圖4 溫度與酶反應(yīng)速度的關(guān)系圖

2.3.3 pH與活性的關(guān)系 由圖5可知，α-淀粉酶在不同的pH下活力不同，在6.5～7.0范圍內(nèi)保持較高的活力，其最適pH為6.9。由于酶活力受pH的影響很大，在最適pH附近最為穩(wěn)定，故在pH為6.9時，α-淀粉酶最有利于與底物結(jié)合并發(fā)生催化作用，活力最高。

圖5 pH與酶反應(yīng)速度的關(guān)系

3 結(jié)論

3.1 采用異丙醇沉淀，硫酸銨鹽溶鹽析和透析相結(jié)合的方法純化α-淀粉酶，酶活力明顯提高。異丙醇沉淀、硫酸銨鹽溶鹽析、透析和反滲透每一步操作都使酶活有所增加，其中反滲透酶的比活力最高（856U/mg），是酶①即粗酶比活力（146U/mg）的5.86倍，可作為實驗用酶。

3.2 在35～40℃溫度范圍內(nèi)保持較高的活力，其最適溫度為37℃；pH在6.5～7.0范圍內(nèi)保持較高的活力，其最適pH為6.9。

［1］李巧枝.生物化學(xué)實驗技術(shù)［M］.北京：氣象出版社，2002：44-45.

［2］吳曉英，張聚寶，等.胰酶制備新工藝的研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報，2005，21（1）：64-67.

［3］徐朝暉，趙愛華，高先富.具降糖活性的牛蒡子提取物的化學(xué)成分［J］.中國天然藥物，2006，4（6）：444.

［4］劉睿，潘思軼，等.高粱原花青素對α-淀粉酶活力抑制動力學(xué)的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（9）：189-192.

［5］陳曾，劉兢，羅丹.生物化學(xué)實驗［M］.合肥：中國科技大學(xué)出版社，1994：26.

Study on isolation，purification and characterization of porcine amylopsin

MIN Yu-tao1，SONG Yan-xian1，XU Feng-cai2，MA Qing-yi2，*
（1.Zhongzhou University，Zhengzhou 450044，China；2.Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China）

The amylopin was extracted from porcine pancreas，partially purified and characterized by using a combination of precipitation with isopropanol，solving-precipitating with ammonium sulfate，dialysis and reverse osmosis.The results showed that the specific activity of amylopin from porcine pancreas was 856U/mg protein，almost 6 times as that of crude enzyme（146U/mg）.The amylopin can be a substitution of commercially available enzyme and used in our experiments.The optimum temperature and pH value were 37℃and 6.9 respectively.

amylopin；salt solvent and salting-out；dialysis；reverse osmosis；specific activity

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）01-0169-04

2010-03-01 *通訊聯(lián)系人

閔玉濤（1978-），男，碩士研究生，助教，研究方向：食品生物技術(shù)。