陳 卿，蔡國林，陸 健，*

（1.江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

樹脂固定化α-乙酰乳酸脫羧酶的初步研究

陳 卿1，2，蔡國林2，陸 健1，2，*

（1.江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

采用7種樹脂對α-乙酰乳酸脫羧酶進行固定化，并將固定化酶應(yīng)用于啤酒發(fā)酵實驗，從中篩選出降低發(fā)酵液中雙乙酰能力較強的大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂D314FD作為固定化的載體。通過單因素和正交實驗確定固定化ALDC的最優(yōu)條件為：每克樹脂加入1.25mL原酶液，吸附時間10h，吸附pH7.5，吸附溫度15℃，在此條件下固定化效率可達44%。發(fā)酵實驗亦表明，固定化ALDC可以顯著降低發(fā)酵液中雙乙酰的含量，降低率達40%以上。

樹脂，α-乙酰乳酸脫羧酶，固定化

在啤酒發(fā)酵過程中，雙乙酰是影響啤酒風味成熟、熟化期長短的主要因素。當雙乙酰含量超過閾值（0.15mg/L）時，會產(chǎn)生令人不愉快的餿酸味，嚴重影響啤酒的口味［1］。啤酒中雙乙酰的來源復(fù)雜，主要是由滲漏到酵母細胞外的代謝產(chǎn)物α-乙酰乳酸，經(jīng)非酶氧化脫羧作用產(chǎn)生。α-乙酰乳酸的非酶氧化脫羧反應(yīng)是緩慢進行的，其速度比雙乙酰還原速度約慢10倍，是雙乙酰還原的限時步驟［2］。傳統(tǒng)除雙乙酰的方法是低溫儲存啤酒，依靠酵母雙乙酰還原酶將其還原成乙偶姻，再由乙偶姻還原酶最終還原為2，3-丁二醇。乙偶姻和2，3-丁二醇的味閾值較高，對啤酒的風味幾乎沒有影響。而這一熟化過程通常需要3～6周時間［3］。α-乙酰乳酸脫羧酶（α-acetolactate decarboxylase，簡稱ALDC，EC 4.1.1.5）可以使啤酒發(fā)酵液中的α-乙酰乳酸不經(jīng)雙乙酰途徑，快速直接脫羧為乙偶姻。因而能縮短雙乙酰的還原時間，加速啤酒的成熟，并可有效控制啤酒在儲藏過程中雙乙酰的反彈［4-6］。將ALDC應(yīng)用于啤酒發(fā)酵，雖可縮短生產(chǎn)周期，但ALDC卻不能反復(fù)使用，增加生產(chǎn)成本。而酶的固定化技術(shù)可以克服游離ALDC的上述缺點［7］。目前固定化技術(shù)基本上都停留在實驗室研究階段，這主要是因為固定化所用的載體材料幾乎都集中在海藻酸鹽、殼聚糖等有機材料上，雖然固定化效果較好，但由于載體材料耐腐蝕性差、不抗壓、易變形，且無法再生，因而限制了此技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用。樹脂是工業(yè)上使用最廣泛的材料之一，其價格低廉、機械強度好、容易再生，作為固定化載體有著廣闊的應(yīng)用前景［8］。本文從7種樹脂中篩選出固定化ALDC效果良好的載體D314FD，對ALDC的固定化條件和固定化酶的應(yīng)用進行相關(guān)研究，期望能夠為工業(yè)化經(jīng)濟、高效應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

ALDC 購自寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司；樹脂分別購自浙江爭光樹脂實業(yè)公司與上海摩速科學(xué)器材有限公司；乙偶姻、2-乙酰-2-甲基乙酰乙酸乙酯（底物） 購自Sigma公司；MES［2-（N-嗎啉代）乙基磺酸］、氯化鈉、Brij35（布里吉）、氫氧化鈉、α-萘酚、肌酸等 均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化載體的預(yù)處理 離子交換樹脂先用蒸餾水浸泡脹潤、去雜，然后用HCl、NaOH交替處理，最后用蒸餾水沖洗至中性；吸附樹脂采用乙醇、蒸餾水交替處理，最后用蒸餾水沖洗至中性，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 載體的選擇 取處理后樹脂約1.00g，分別加入5mL含一定量原酶液的磷酸緩沖液（pH6.0、0.2mol/L）中，搖勻，在搖床上15℃，120r/min振搖12h后抽濾，用去離子水洗滌數(shù)次，至洗滌液中無蛋白檢出。將所得固定化ALDC應(yīng)用于啤酒發(fā)酵實驗，根據(jù)固定化酶對發(fā)酵液中雙乙酰的降低率進行固定化載體的選擇。

1.2.3 ALDC固定化條件的優(yōu)化 取適量預(yù)處理樹脂，用濾紙吸干表面的水分，稱取0.20g，加入不同體積的原酶液，并用0.2mol/L，pH5.0～8.5的磷酸緩沖液補充至5mL，在5～25℃，120r/min下吸附固定1～12h。抽濾，并用去離子水反復(fù)洗滌樹脂，抽濾得到固定化酶，置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 游離酶活力測定 將樣品酶液進行稀釋，取20μL稀釋酶液于試管中，加 MES緩沖液300μL，30℃水浴預(yù)熱10min，將底物混合液同時放入30℃水浴預(yù)熱10min；在反應(yīng)管中加入80μL底物混合液，迅速混勻后立即置于30℃恒溫水浴中，精確反應(yīng)20min后，迅速加入4.6mL顯色劑（0.1%肌酸，1% α-萘酚的1mol/L NaOH溶液），混勻，置30℃顯色40min后于522nm處讀取吸光值。用MES緩沖液代替樣品酶液的反應(yīng)管作為空白對照。

酶活力定義：在pH6.0，30℃條件下，每分鐘水解出1μmol乙偶姻的量定義為一個酶活單位（U）。

1.2.5 固定化酶活力測定 取適量固定化酶代替20μL稀釋酶液于試管中，之后步驟同1.2.4。

1.2.6 雙乙酰、酒精度、外觀濃度、真正濃度、α-FAN的測定 參考文獻［9］。

1.2.7 計算方法［10］相對酶活力：以同組樣品中酶活力的最大值作為100%，其它值與最大值的百分比即為相對活力；固定化效率（%）=（加入酶總活力-上清液酶總活力）/加入酶總活力×100%；雙乙酰降低率（%）=（加酶前雙乙酰含量-加酶后雙乙酰含量）/加酶前雙乙酰含量×100%

1.2.8 正交實驗數(shù)據(jù)處理方法 本實驗需要考察兩個指標，一個是固定化酶活力（x），另一個是固定化效率（y）。這兩個指標的重要性有所不同，固定化酶活力的重要性比固定化效率的重要性大，因而確定二者的權(quán)重系數(shù)分別為2/3和1/3，按照加權(quán)平均法進行數(shù)據(jù)處理，通過公式z=（2/3）x+（1/3）y，得到綜合評分z。

1.2.9 常規(guī)發(fā)酵實驗方法 主酵使用下面酵母，11℃將酵母接入11°P左右的麥汁中，按照圖1的發(fā)酵工藝進行發(fā)酵。

圖1 發(fā)酵工藝曲線

1.2.10 固定化ALDC啤酒連續(xù)發(fā)酵方法 按照圖1所示的方法，待發(fā)酵至后酵2.5d時，將發(fā)酵液存于緩沖罐1中，通過恒流泵2將其以一定的流速泵入固定化ALDC酶反應(yīng)柱3中，進行啤酒連續(xù)發(fā)酵，還原其中的雙乙酰，最終所得啤酒存于貯罐4中。將該系統(tǒng)放于生化培養(yǎng)箱中，控制系統(tǒng)的反應(yīng)溫度，并在酶反應(yīng)柱進、出口處分別設(shè)有取樣口。

圖2 固定化α-乙酰乳酸脫羧酶啤酒連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂載體的選擇

本實驗中采用物理結(jié)合法對ALDC進行固定化，其是依靠離子鍵、氫鍵、范德華力等結(jié)合的一種固定化方法，該方法載體價廉易得，安全無毒，操作條件溫和簡單，易于工業(yè)化放大生產(chǎn)應(yīng)用。所選用載體的物理化學(xué)性質(zhì)對酶的固定化效果有重大影響，不同樹脂對ALDC固定化效果的影響如表1所示。從表1中可以看出，不同載體對ALDC的固定化效果差別顯著，其中丙烯酸系大孔弱堿性陰離子交換樹脂D314FD固定ALDC，可以有效地降低發(fā)酵液中的雙乙酰的含量，雙乙酰降低率達50%以上，降低效果顯著。通過重復(fù)實驗，最終確定選擇D314FD作為ALDC的固定化載體，并對其最適固定化條件做了進一步的研究。

2.2 單因素實驗研究反應(yīng)條件對ALDC固定化的影響

2.2.1 加酶量對固定化效果的影響 按照1.2.3方法，恒定其他條件（pH6.0，溫度15℃，吸附時間8h），選擇不同的原酶液添加量（0.25、0.50、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50mL）分別制備固定化ALDC，測定固定化酶活力。研究不同加酶量對固定化效果的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3可知，隨著加酶量的增加，固定化酶的相對酶活力和固定化效率均有所增加，當5mL酶液中原酶液的添加量為1.25mL時，相對酶活力增幅緩慢；在此添加量之后，隨著加酶量的增加，載體上酶分子密度增大，位阻效應(yīng)加劇，底物和產(chǎn)物的擴散受到某種程度的限制，導(dǎo)致固定化效率開始呈降低趨勢［11］，兼顧固定化酶相對活力和固定化效率這兩者，選擇5mL酶液中原酶液的添加量為1.25mL，此時ALDC的固定化效率可達43%。

表1 不同樹脂對α-乙酰乳酸脫羧酶固定化效果的影響

圖3 加酶量對固定化效果的影響

2.2.2 吸附時間對固定化效果的影響 在上述實驗基礎(chǔ)上，研究不同吸附時間（1、2、4、6、8、10、12h）對固定化酶活力和固定化效率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 吸附時間對固定化效果的影響

從圖4可以看出，10h為最佳吸附時間。10h之前，隨著吸附時間的延長，酶的相對活力和固定化效率呈上升趨勢；當吸附時間高于10h時，隨著時間的延長，固定化效率呈下降趨勢。一方面是因為10h時，固定化酶的相對活力不再增加，樹脂吸附ALDC達到飽和；另一方面，隨著吸附時間的延長，游離酶活力下降。因此選擇 10h作為 D314FD固定化ALDC的吸附時間。

2.2.3 吸附溫度對固定化效果的影響 在上述實驗基礎(chǔ)上，研究不同吸附溫度（5、10、15、20、25℃）對固定化酶活力和固定化效率的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖5可知，當吸附溫度在10～15℃時，吸附溫度的微小變化不會引起固定化酶相對活力和固定化效率的急劇變化；當溫度大于15℃時，固定化酶相對活力和固定化效率降低速度加快。其原因可能是，長時間的振蕩，使得部分ALDC活力有所下降［12］。鑒于蛋白質(zhì)的吸附是一個吸熱過程，因此選擇15℃作為ALDC的固定化溫度。

圖5 吸附溫度對固定化效果的影響

2.2.4 吸附pH對固定化效果的影響 在上述實驗基礎(chǔ)上，即每克樹脂加1.25mL原酶液，15℃，吸附10h條件下，改變吸附pH，研究不同pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）對固定化效果的影響，結(jié)果如圖6所示。從圖6可知，pH在7.0～7.5時，固定化效果最好。低于或高于此pH，固定化效率都有所降低。這主要是因為緩沖液pH的改變，會造成載體表面、酶分子表面的電荷分布以及載體與酶分子之間作用力的改變。已知所使用ALDC的等電點為4.5，所以一定要保證吸附pH大于4.5，使酶蛋白帶負電荷，與陰離子交換樹脂進行離子交換將其吸附到載體上；但若pH過高，也會影響ALDC的活性中心進而使固定化酶活力降低。

圖6 吸附pH對固定化效果的影響

2.3 正交實驗確定ALDC固定化最優(yōu)條件

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以加酶量、吸附時間、溫度、pH四個因素的不同水平進行正交實驗，考察不同因素之間對固定化效果影響的綜合效應(yīng)，確定ALDC固定化的最優(yōu)條件，結(jié)果見表2和表3。

表2 正交實驗因素水平

從表3數(shù)據(jù)可以看出，不同的固定化條件，所制得的固定化ALDC的酶活力和固定化效率有一定的差別。其中第4組實驗的綜合得分最高，固定化酶的活力最高，固定化效率為42.72%，實驗條件為A2B1C2D3。根據(jù)正交實驗的極差分析可知：C因素（吸附溫度）的極差值6.776最大，故其對ALDC固定化效果的影響也最大；D因素（吸附pH）的極差值2.800最小，對固定化效果的影響也較小。四個因素對ALDC固定化效果影響的主次順序為：吸附溫度＞加酶量＞吸附時間＞吸附pH。通過K值確定最優(yōu)水平組合為：A2B2C2D3，即加酶量1.25mL，吸附時間10h，吸附溫度15℃，pH7.5。而該條件在表3所列的實驗中并沒有出現(xiàn)，因此需要對此條件進行驗證。以最優(yōu)組合進行實驗，測定固定化酶活力和計算固定化效率，結(jié)果表明：固定化酶的相對活力為105%，固定化效率為44%，其綜合評分（z）為84.67，最高。通過驗證實驗，說明正交實驗的結(jié)論是正確的。

表3 正交實驗結(jié)果

2.4 固定化ALDC在釀造啤酒上的應(yīng)用

為了進一步驗證ALDC的固定化效果，并初步探索固定化ALDC在啤酒釀造中的應(yīng)用模式及其工藝，本文設(shè)計了重復(fù)分批酶解實驗和連續(xù)酶解實驗。2.4.1 重復(fù)分批酶解實驗 在250mL三角瓶中加入200mL發(fā)酵一定時間的嫩啤酒發(fā)酵液和10g（以濕重計）固定化ALDC，在6℃，80r/min條件下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，取樣測定雙乙酰的含量，計算雙乙酰降低率。同時將分離出來的固定化ALDC，用無菌水反復(fù)洗滌數(shù)次后，添加到新的發(fā)酵液中進行下一批次的酶解反應(yīng)。如此重復(fù)進行8次實驗，結(jié)果如圖7所示。

圖7 固定化α-乙酰乳酸脫羧酶重復(fù)分批酶解實驗結(jié)果

從圖7中可知，隨著固定化ALDC使用次數(shù)的增加，其雙乙酰降低率由43%降至35%，降幅較小。所以，通過固定化條件的優(yōu)化，所制備的固定化ALDC的催化性能相當穩(wěn)定，且催化活力較高。這一結(jié)果對于提高酶的重復(fù)利用率，降低生產(chǎn)成本具有重大意義。

2.4.2 連續(xù)發(fā)酵實驗 在120mL自制玻璃柱中裝填濕重35g固定化ALDC，將發(fā)酵至后酵2.5d的嫩啤酒發(fā)酵液通過恒流泵以0.165mL/min的流速由底部進料，頂部出料，此時反應(yīng)體系的保留時間約為12h，待系統(tǒng)達到穩(wěn)態(tài)后，對流出樣進行常規(guī)理化指標的測定（多次測定，取平均值），與實驗室傳統(tǒng)后酵發(fā)酵液相應(yīng)指標進行比較。并通過t檢驗，比較了柱前、柱后發(fā)酵液常規(guī)理化指標間的差異性，結(jié)果如表4和表5所示。

表4 啤酒主要理化指標的比較

表5 反應(yīng)柱前與柱后發(fā)酵液常規(guī)理化指標間t檢驗結(jié)果

從表4可知，固定化ALDC反應(yīng)柱前和柱后發(fā)酵液中雙乙酰含量差別顯著，在保留時間為12h后，固定化柱流出液中的雙乙酰含量為0.090mg/L，雙乙酰降低率達44%。通過對反應(yīng)柱前與柱后發(fā)酵液其他常規(guī)理化指標進行t檢驗（表5），結(jié)果表明：在外觀濃度和真正濃度這兩項指標上柱前與柱后發(fā)酵液間存在差異，從表4亦可知，固定化柱后比柱前發(fā)酵液的外觀濃度和真正濃度平均低約0.2°P；而外觀發(fā)酵度和實際發(fā)酵度是通過外觀濃度和真正濃度計算得出，故而也存在一定的差異。這主要是因為樹脂部分吸附發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的緣故所致。實驗室常規(guī)后酵工藝至少需要7d才可以將雙乙酰含量降至0.100mg/L，而采用固定化ALDC新工藝釀造啤酒達到相同的雙乙酰含量水平時只需要3d左右即可，故而采用新工藝可以明顯縮短發(fā)酵時間。從表4可知，使用固定化酶連續(xù)工藝生產(chǎn)的啤酒，其主要理化指標（除雙乙酰）與常規(guī)工藝生產(chǎn)的啤酒比較接近。

3 結(jié)論

據(jù)相關(guān)文獻報道，已經(jīng)研究了殼聚糖、聚乙烯醇、磁性淀粉和IMMOPORE（一種多孔玻璃）等材料作為固定化 ALDC的載體［3，13-15］，而用樹脂進行ALDC固定化的報道甚少。由于ALDC主要應(yīng)用于釀酒行業(yè)，本文所選用的ALDC固定化載體D314FD樹脂，屬于食品級樹脂，因而使得固定化ALDC在使用上具有安全性。

本文應(yīng)用吸附法固定化ALDC，方法簡單，操作容易。通過單因素和正交實驗得出固定化ALDC的最優(yōu)條件為：在pH7.5磷酸緩沖液下，每克樹脂加入1.25mL原酶液，15℃吸附10h。在此條件下固定化ALDC的固定化效率可達44%。

將采用優(yōu)化條件制得的固定化ALDC初步應(yīng)用于啤酒釀造實驗，發(fā)現(xiàn)固定化ALDC的催化效率較高，性能穩(wěn)定，重復(fù)使用8次后雙乙酰降低率降幅較小。采用固定化ALDC反應(yīng)柱系統(tǒng)進行啤酒連續(xù)發(fā)酵，在保留時間為12h時，該工藝所得的發(fā)酵液與常規(guī)工藝的發(fā)酵液，在常規(guī)理化指標上比較接近，并沒有顯著差異。ALDC固定化的成功為其在工業(yè)上的應(yīng)用提供了參考。

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Preliminary study on immobilization of α-acetolactate decarboxylase by resin

CHEN Qing1，2，CAI Guo-lin2，LU Jian1，2，*
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Alpha-acetolactate decarboxylase was immobilized on 7 kinds of resins through adsorption，and then they were used in beer maturation.Among them，weak macroporous ion-exchange resin D314FD was selected as immobilized carrier for its good ability on reducing the content of diacetyl.The results showed that the optimum conditions for α-acetolactate decarboxylase immobilized as follows：1.25mL liquid α-acetolactate decarboxylase was added into one gram of pretreated resin，stirred for 10h at 15℃ in buffer of pH7.5.Under the optimal conditions，the immobilization efficiency could reach 44%.Fermentation trial also showed that immobilized ALDC could significantly reduce the content of diacetyl，and the rate of reducing was up to 40%.

resin；α-acetolactate decarboxylase；immobilization

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）02-0154-05

2010-03-04 *通訊聯(lián)系人

陳卿（1985-），女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

國家“十一五”支撐重點項目資助（2008BAI63B06）；國家“十一五”支撐計劃項目（2007BAK36B01）；江蘇省“青藍工程”資助項目。