高義霞，楊 聲，周向軍，張 繼，2，*，張 花

（1.天水師范學院生命科學與化學學院，甘肅天水741001；2.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070）

羅望子多糖硫酸酯的制備及表征

高義霞1，楊 聲1，周向軍1，張 繼1，2，*，張 花1

（1.天水師范學院生命科學與化學學院，甘肅天水741001；2.西北師范大學生命科學學院，甘肅蘭州730070）

利用水提醇沉、Sevage法及木瓜蛋白酶法從食品級的羅望子膠中分離、純化羅望子多糖，得到的羅望子多糖純度為92.7%。采用氯磺酸-吡啶法合成羅望子多糖硫酸酯，元素分析法測得其取代度為1.4；紅外表征發(fā)現(xiàn)硫在合成產物中以S=O雙鍵和C-O-S形式存在。

羅望子，硫酸化多糖，紅外光譜，元素分析

多糖硫酸酯是多糖大分子鏈中單糖分子鏈上的某種羥基被硫酸根所取代而形成的一類化學結構復雜、生物活性多樣、構效關系鮮明的多糖衍生物。近年來發(fā)現(xiàn)硫酸酯化多糖具有多種生物活性，如增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒等［1］。天然的硫酸多糖主要來源于動物、植物、微生物的不同組織中，但其種類和含量少。1988年，日本學者Mizumoto等人首次將硫酸基團引入到一些均多糖結構中，發(fā)現(xiàn)硫酸化多糖能抑制T淋巴細胞病毒，至此，硫酸化成為多糖結構修飾中的一個重要方面［2］。為了提高多糖的生物活性，可通過硫酸化修飾等方法對其進行結構改造，獲取更多的多糖硫酸酯。羅望子膠是豆科羅望子屬植物（Tamarindus indica L.）果實中的果核胚乳部分，易分散于冷水中，加熱則形成粘稠狀液體［3］。通常約含有15%～22%的蛋白質，0.7%～8%粗纖維，4%～7%油脂，2%～3%灰分及65%～72%左右的多糖。其多糖主要是由D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖（1∶3∶4）組成的中性聚多糖，除多糖外，還有少量游離的L-阿拉伯糖。羅望子多糖的分子結構中，主鏈為β-D-1，4-連接的葡萄糖，側鏈是α-D-1，6-連接的木糖和β-D-1，2-連接的半乳糖，由此構成了支鏈極多的多糖類物質［4］。羅望子多糖有良好的耐熱、耐鹽、耐酸、耐冷凍和解凍性，具有穩(wěn)定、乳化、增稠、凝結、保水、成膜的作用，其水溶液的粘稠性較強，黏度不受酸類和鹽類等的影響［5-6］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，羅望子多糖是葡聚木糖，它是一種理想的膳食纖維來源，可起到防治高血壓的作用，另外，還可增加小腸非擾動層的厚度，減弱糖類物質的吸收，防止糖尿病的發(fā)生發(fā)展，具有無明顯毒副作用以及應用過量不致產生低血糖等特性。但由于羅望子多糖粘度較高，影響了其在體內的吸收，進而影響了其活性作用，因此制備羅望子多糖硫酸酯，改變其物理特性，增加其生物活性，意義重大。本研究對羅望子多糖進行硫酸酯化研究并利用紅外光譜掃描、元素分析等方法對酯化多糖進行表征，為后續(xù)的藥理研究奠定理論基礎。硫酸酯化的方法很多，常用方法包括：濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-甲酰胺法等［7］，有研究發(fā)現(xiàn)氯磺酸-吡啶法操作簡單、反應條件溫和、產物回收容易、收率較高，是硫酸化多糖較為理想的一種方法［8］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅望子膠 食品級，甘肅省弘諾科技貿易有限公司；氯磺酸、吡啶、二甲基甲酰胺 均為國產分析純。

PLPHR 1-4LD真空冷凍干燥機，NOCOLET FT-IR360，Elementar Analysensysteme GmbH，722可見分光光度計等。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅望子多糖制備 準確稱取羅望子膠10g，溶脹于1000mL水中，80℃水浴提取2h。4層紗布過濾，棄濾渣，濾液離心后，上清液濃縮至200mL，加入4倍量75%乙醇4℃沉淀過夜，離心，沉淀冷凍干燥至恒重得粗多糖。取上述粗多糖，以固液比1∶100（m/v）加入蒸餾水于70℃水浴中溶解，用Sevage+木瓜蛋白酶法除蛋白［9］，上清液依次用流水和蒸餾水各透析1d（用1%AgNO3檢測蒸餾水透析后的袋內及袋外物無白色沉淀生成），透析后的糖液濃縮至原體積的1/4倍后，加入乙醇使其濃度達到75%～80%，置4℃冰箱過夜，離心分離，收集沉淀并依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌兩次，冷凍干燥至恒重，得羅望子多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 利用蒽酮硫酸法［10］對上述制備的羅望子多糖含量進行測定。分別取0.1g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，用蒸餾水補到1.00mL；分別加入4.00mL蒽酮試劑，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新沸騰起，準確煮沸10min取出，用自來水冷卻，室溫放置10min左右，于620nm比色。以同樣處理的重蒸餾水為空白，進行比色。以光密度為縱坐標，糖的含量（μg/mL）為橫坐標，得標準曲線。取40μg/mL羅望子多糖溶液1.00mL，加入蒽酮試劑，同標準曲線操作，比色測定，根據(jù)標準曲線和樣品濃度計算含量。

1.2.3 羅望子多糖硫酸酯的制備

1.2.3.1 酯化試劑的制備 將附有冷凝、攪拌和恒壓漏斗裝置的反應器置于0℃冰鹽浴中，加入24mL預冷的無水吡啶到三頸燒瓶中，攪拌使之充分冷卻。打開恒壓漏斗的活塞，再將約4mL氯磺酸30min內逐滴加入，見燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體，停止反應，-20℃保存?zhèn)溆茫?1］。

1.2.3.2 酯化反應 稱取0.5g上述制備的羅望子多糖加入到約15mL的二甲基甲酰胺（DMF）中，超聲處理20min后，加入盛有上述酯化試劑的三頸燒瓶中，立即將其移入沸水浴，密封，恒溫磁力攪拌反應2h。取出三頸燒瓶，冷卻至0℃，用0℃的2.5mol/mL的氫氧化鈉中和pH至中性，加入3倍體積無水乙醇，析出沉淀，過夜離心收集沉淀，并將沉淀用適量水溶解，用自來水透析2d，蒸餾水透析1d。袋內物濃縮，冷凍干燥，得羅望子多糖硫酸酯。

1.2.4 羅望子多糖硫酸酯的鑒定

1.2.4.1 紅外光譜分析 采用溴化鉀壓片法對硫酸基進行定性分析。

1.2.4.2 元素分析法 利用元素分析法測定硫酸酯化多糖中碳、氫、氮及硫含量，并計算取代度。取代度公式：DS=（1.62×S%）/（32-1.02×S%），其中，DS為取代度，S%為硫的百分含量。

2 結果與分析

2.1 羅望子多糖含量測定

取40μg/mL羅望子多糖水溶液，以上述制作標準曲線方法測定其吸光度為0.228，由回歸方程可計算出，純化的羅望子多糖純度為92.7%。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 紅外光譜分析

羅望子多糖及其硫酸酯紅外光譜見圖2，可知羅望子多糖在3436.04cm-1處有一強而寬的峰，是分子鍵氫鍵締合的羥基O-H的伸縮振動產生的，它是多糖的特征吸收峰；而經硫酸化修飾后，可看出此處的峰移向3438.20cm-1，并且峰變窄變弱，表明由于硫酸基的取代，改變了局部的空間位置情況，使得羥基參與分子氫鍵的狀態(tài)發(fā)生了變化，有利于提高多糖的水溶性。峰高度的削弱表明硫酸基發(fā)生了取代，使羥基的數(shù)量減少。硫酸酯化后的多糖峰中1262.78、821.04cm-1是硫酸基的特征吸收。1262.78cm-1處的峰是O-SO3-的S=O雙鍵的伸縮振動，821.04cm-1峰是C-O-S的伸縮振動。

圖2 羅望子多糖及其硫酸酯紅外光譜

2.3 元素分析

由表1可知，經元素分析，硫酸化羅望子多糖及其硫酸酯含氮量都為0，表明它們都不含有蛋白質；硫酸化后，S的含量達14.7%，由取代度公式計算出其取代度為1.4。

表1 N、H、C、S元素分析結果

3 結論

本研究利用氯磺酸-吡啶法合成羅望子多糖硫酸酯，元素分析法檢測含硫量可計算出取代度為1.4；利用紅外光譜表征可知，硫在合成產物中以S= O雙鍵和C-O-S形式存在。對羅望子多糖硫酸酯化的修飾，旨在生產成本低廉、產物量大、生物學活性高、應用廣泛的羅望子硫酸多糖，為羅望子的深度開發(fā)和其在醫(yī)藥方面的應用提供參考。

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Preparation and characterization of sulfated tamarind polysaccharide

GAO Yi-xia1，YANG Sheng1，ZHOU Xiang-jun1，ZHANG Ji1，2，*，ZHANG Hua1
（1.College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China；2.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）

A water-soluble polysaccharide was extracted from tamarind seed gum by method of boiling water and ethanol deposition.The crude polysaccharide was deproteined by Sevage combined with papain.The content of polysaccharides was 92.7%.Tamarind seed polysaccharides were sulfated by chlorosulfonic-pyridine methods，and its substitution degree was 1.4 measured by methods of elemental analysis.lR characterization showed that sulfur existed in the title products in the form of S=O and C-O-S.

Tamarindus indica L.；sulfated polysaccharide；lR；elemental analysis

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0142-03

2010-01-25 *通訊聯(lián)系人

高義霞（1982-），女，助教，研究方向：資源植物學。