解秋菊，閆培生，池振明

（1.哈爾濱工業(yè)大學（威海）海洋學院，山東威海264209；2.中國海洋大學海洋生命學院，山東青島266003）

真姬菇發(fā)酵海帶廢渣制備多糖的抗氧化活性

解秋菊1，閆培生1，池振明2

（1.哈爾濱工業(yè)大學（威海）海洋學院，山東威海264209；2.中國海洋大學海洋生命學院，山東青島266003）

利用試劑盒法測定了真姬菇液態(tài)發(fā)酵海帶廢渣后發(fā)酵上清液中多糖的抗氧化能力，結果表明，在多糖濃度為0.5mg/mL時，真姬菇31菌株發(fā)酵上清液中的多糖（簡稱31菌株多糖）對羥自由基的抑制率比海帶廢渣水溶液上清中的多糖（簡稱對照多糖）高了17.6%，對照多糖的IC50為1.94mg/mL，31菌株多糖的IC50為0.55mg/mL；多糖濃度為10mg/mL時，31菌株多糖對超氧陰離子自由基的抑制率比對照多糖高了14.6%；多糖濃度在0.6mg/mL時，31菌株多糖的總抗氧化能力比對照多糖高出了35.76%。通過實驗可以得出：真姬菇發(fā)酵海帶廢渣后獲得的多糖抗氧化活性比未發(fā)酵海帶廢渣中的多糖抗氧化活性顯著提高，從而為海帶廢渣的高附加值再利用提供了科學依據。

真姬菇，液態(tài)發(fā)酵，海帶廢渣，多糖，抗氧化

海帶廢渣是在工業(yè)上用海帶提取碘、甘露醇、褐藻酸鈉后剩余的殘渣，含有數十種礦物元素、脂肪和磷脂、有機酸、醛、酮、醇，單糖、雙糖、淀粉、肝糖、菊糖、纖維素、果膠類物質（半纖維素）、單寧類物質、蛋白質和礦物質等。按干物質計，海帶的工業(yè)利用率僅為30%，還有約2/3的海帶成分尚未得到利用，不僅浪費了大量的自然資源，還帶來一系列環(huán)境污染問題［1］。真姬菇，學名Hypsizigus marmoreus，又名玉蕈、斑玉蕈、海鮮菇、膠玉蘑、鴻喜菇、蟹味菇、假松茸等，是一種高營養(yǎng)價值、低熱量、低脂肪的食品，具有良好保健功能［2］，其子實體提取物有抗自由基、抗氧化和延緩衰老等功效［3-5］。據報道［6-7］，真姬菇液體發(fā)酵所得食用菌菌絲體中的多糖含量遠高于子實體，并且發(fā)酵液中含有大量的胞外多糖。利用真姬菇的生物學特性，對海帶廢渣進行液體發(fā)酵，研究和生產出新一代保健食品，極大地提高了海帶廢渣的高附加值，還可以消除污染，改善環(huán)境。本文研究了真姬菇液態(tài)發(fā)酵海帶廢渣發(fā)酵液上清多糖的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羥自由基測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測試盒、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒 均購自南京建成生物工程研究所；海帶廢渣 榮成市尋山漁業(yè)公司；真姬菇31菌株 由本實驗室篩選保存。

4K-15高速冷凍離心機 Sigma；Alpha1-2/LD-plus冷凍干燥機 Christ；MK3酶聯免疫分析儀Thermo。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的制備 將海帶廢渣磨成干粉，配制成7%的水溶液，同時添加0.2%的葡萄糖和0.09%的牛肉浸粉，pH自然，121℃滅菌30min。將真姬菇平板菌種打孔取塊，接種于海帶廢渣液體培養(yǎng)基，25℃，110r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，以不接種的海帶廢渣溶液作對照。12d后，將發(fā)酵產物4000r/min，10min離心，收集上清液，然后加入3倍體積的無水乙醇，混勻，4℃靜置過夜后，5000r/min離心20min，沉淀用95%乙醇洗2次后，-20℃冷凍，冷凍干燥機中凍干，稱重。

1.2.2 多糖清除羥自由基能力測定 將對照多糖、31菌株多糖分別用蒸餾水配制成0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL系列濃度，按試劑盒說明書提供的方法進行測定，每個濃度做三個平行，用酶標儀于550nm處測吸光度。

1.2.3 多糖清除超氧陰離子自由基能力測定 將對照多糖、31菌株多糖分別用蒸餾水配制成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0mg/mL系列濃度，按試劑盒說明書提供的方法進行測定，每個濃度做三個平行，用酶標儀于550nm處測吸光度。

1.2.4 多糖總抗氧化能力測定 將31菌株多糖和對照多糖分別用蒸餾水配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0mg/mL系列濃度，每個濃度做三個平行，用酶標儀于520nm處測吸光度，按試劑盒說明書提供的方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 多糖清除羥自由基能力的比較

由圖1可以看出，31菌株多糖清除羥基自由基的能力明顯高于對照多糖，且抑制率隨著多糖濃度的增大而增加。31菌株多糖在濃度為0.1～0.5mg/mL時其抑制率增加較慢，當大于0.5mg/mL時，抑制率從45.62%很快升至81.42%，在濃度為4mg/mL時抑制率達到85.79%，其IC50為0.55mg/mL。對照多糖的抑制率隨著多糖濃度的升高逐漸增加，其 IC50為1.94mg/mL。對二者IC50做t檢驗(p＞0.05差異不顯著；0.05＜p＜0.01差異顯著；p＜0.01差異極其顯著)，結果表明p＜0.01，差異極其顯著。

圖1 對照多糖、31菌株多糖的清除羥自由基測定結果

按照羥自由基試劑盒要求，抑制率在45%～55%之間所對應的濃度是樣品的最佳濃度。通過實驗結果得知，31菌株多糖在濃度為0.5mg/mL時，抑制率為45.60%，符合試劑盒要求，因此在該濃度下，比較對照多糖、31菌株多糖抗羥自由基能力，見圖2。

從圖2實驗結果可以看出，加樣量相同、多糖濃度相同的情況下，31菌株多糖對羥自由基的抑制率比對照多糖高出17.6%。對二者抑制率做t檢驗，p=0.0003，差異極其顯著。

圖2 對照多糖、31菌株多糖清除羥自由基和超氧陰離子自由基能力的比較

2.2 多糖清除超氧陰離子自由基能力的比較

由圖3可以看出，31菌株多糖清除超氧陰離子自由基的能力高于對照多糖。31菌株多糖在低濃度范圍內，抑制率隨濃度的升高而增強，當多糖濃度從2mg/mL升至 10mg/mL時，抑制率增加較快，從6.32%升至26.77%，多糖濃度大于10mg/mL時，抑制率增加很慢，幾乎接近于直線，在16mg/mL時，抑制率僅為28.63%。對照多糖對超氧陰離子自由基的抑制率隨濃度的變化與31菌株多糖相似，但不明顯。

圖3 對照多糖、31菌株多糖的抗超氧陰離子自由基測定結果

從圖3實驗結果可以看出，多糖濃度為10mg/mL時，是抑制率快速增加的轉折點，因此在該濃度下比較對照多糖、31菌株多糖清除超氧陰離子自由基能力，見圖2。

從圖2實驗結果可以看出，加樣量相同、多糖濃度相同的情況下，31菌株多糖對超氧陰離子自由基的抑制率比對照多糖高出14.6%。對二者抑制率做t檢驗，p＜0.01，差異極其顯著。

2.3 多糖總抗氧化能力的比較

從圖4實驗結果可以看出，31菌株多糖的總抗氧化能力隨多糖濃度的增加變化較大，在0.6mg/mL時總抗氧化能力達到最高，為2.164單位/mg多糖，當多糖濃度繼續(xù)增加時，其總抗氧化能力則減少，至多糖濃度為6mg/mL時，總抗氧化能力減少為1.150單位/mg多糖；對照多糖的總抗氧化能力也表現出與31菌多糖相似的趨勢，在多糖濃度為0.4～2mg/mL范圍內，總抗氧化能力逐漸增加，當多糖濃度為2mg/mL時，總抗氧化能力達最高為1.811單位/mg多糖，多糖濃度繼續(xù)增加時，總抗氧化能力則逐漸降低。多糖濃度在0.2～0.6mg/mL時，31菌株多糖的總抗氧化能力高于對照多糖，當大于0.8mg/mL時，31菌株多糖的總抗氧化能力低于對照多糖。多糖濃度在0.6mg/mL時（即31菌株多糖的總抗氧化能力達到最高），31菌株多糖的總抗氧化能力比對照多糖高出了35.76%。對二者最高抗氧化能力做t檢驗，p= 0.022，差異顯著。

圖4 對照多糖、31菌株多糖的總抗氧化能力測定結果

3 結論

本實驗測定了真姬菇液態(tài)發(fā)酵海帶廢渣所得多糖的清除羥自由基、超氧陰離子自由基和總抗氧化能力，通過實驗得出結論：真姬菇31菌株多糖清除羥自由基、清除超氧陰離子自由基和總抗氧化能力都比對照多糖的高，實驗結果表明真姬菇對海帶廢渣的發(fā)酵有明顯的效果。

4 討論

食藥用真菌多糖既可存在于真菌菌絲和子實體中，也可存在于發(fā)酵培養(yǎng)液中，對食藥用真菌液體發(fā)酵胞外多糖的活性研究已成為開發(fā)食藥用真菌的重要內容之一。葉明等［8］報道了隨著黑芝發(fā)酵后胞外多糖濃度的增加，其對羥基自由基的清除能力逐漸增強，與本實驗結果一致，但對羥自由基的抑制率在多糖濃度為40mg/mL時達到39.85%，低于本實驗的結果（31菌株多糖在濃度為4mg/mL時，對羥自由基的抑制率為85.79%）。陳宏偉等［9］研究了蛹蟲草胞外鋅多糖的抗氧化能力，其對羥自由基和氧自由基的清除率都隨多糖濃度的提高而增加，本實驗結果與其一致，但其對羥自由基的IC50=1.63mg/mL，低于本實驗的結果（31菌株多糖對羥自由基的IC50= 0.55mg/mL），其對氧自由基的IC50=4.97mg/mL，高于本實驗的結果（31菌株多糖對超氧陰離子自由基的清除率最高達到28.63%）。

李順峰等［10］報道真姬菇子實體多糖體外抗氧化特性研究表明，真姬菇子實體多糖粗品對超氧陰離子自由基有一定清除效果，在濃度為10mg/mL時抑制率達到最高，約30%左右，效果不太明顯，本實驗結果與其一致（31菌株多糖對超氧陰離子自由基的清除率在濃度為10mg/mL時為26.77%）；真姬菇子實體多糖粗品對羥自由基的清除率在5mg/mL左右時達到最高，為80%左右，清除能力較強，本實驗結果與其一致（31菌株多糖對羥自由基的清除率在濃度為4mg/mL時為85.79%）。且在所選濃度范圍內，兩種清除能力都隨著濃度升高而增加。本研究結果與該報道非常接近，表明真姬菇液體發(fā)酵海帶廢渣所得胞外多糖的抗氧化活性接近于真姬菇子實體多糖。

本實驗用海帶廢渣作為培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)真姬菇，實驗結果證明，發(fā)酵液多糖的抗氧化活性明顯提高，對真姬菇液體發(fā)酵的研究和海帶廢渣高附加值利用都有一定的意義，對于所得菌絲體多糖的活性有待進一步研究。

［1］汝少國，李永祺，白逢偉，等.嶗山啤酒廠、海藻養(yǎng)殖化工廠污水對扁藻的生長效應［J］.海洋環(huán)境科學，1994，13（4）：56-62.

［2］上官舟建，林汝楷，張運茂.真姬菇生物學特性的研究［J］.食用菌學報，2004，11（4）：1-7.

［3］Lee Y L，Yen M T，Mau J L.Antioxidant properties of various extracts from Hypsizigus marmoreus［J］.Food Chemistry，2007，104（1）：1-9.

［4］Chang J S，Son J K，Li G，et al.Inhibition of cell cycle progression on HepG2 cells by hypsiziprenol A9，isolated from Hypsizigus marmoreus［J］.Cancer Letters，2004，212（1）：7-14.

［5］Ukawa Y，Ito H，Hisamatsu M.Antitumor effects of（1→3）-β -glucan and（1→6）-β-glucan purified from newly cultivated mushroom，Hatakeshimeji（Lyophyllum decates Sing.）［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，90（1）：98-104.

［6］董秀萍.液體種子種齡對姬松茸深層發(fā)酵的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（6）：59-63.

［7］王萍，師俊玲.真姬菇液體培養(yǎng)用菌種及其營養(yǎng)因子篩選［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（3）：70-73.

［8］葉明，陳久山，楊柳，等.黑芝胞外多糖提取工藝條件優(yōu)化及體外抗氧化活性研究［J］.食品科學，2009，30（8）：47-50.

［9］陳宏偉，陳安徽，邵穎，等.蛹蟲草胞外鋅多糖抗氧化能力的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（6）：54-57.

［10］李順峰，張麗華，付娟妮.真姬菇子實體多糖體外抗氧化特性研究［J］.西北農業(yè)學報，2008，17（4）：302-305.

Antioxidant activity of exopolysaccharide from fermented kelp waste by Hypsizigus marmoreus

XIE Qiu-ju1，YAN Pei-sheng1，CHI Zhen-ming2
（1.School of the Ocean，Harbin Institute of Technology at Weihai，Weihai 264209，China；2.College of Marine Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The antioxidant activity of polysaccharides from the supernatant of fermentation by Hypsizigus marmoreus 31 with medium of kelp waste was detected by using the kit.The results showed that at the 0.5mg/mL，the inhibition rate of hydroxyl radical of the polysaccharide from fermentation supernatant was higher by 17.6% than from supernatant of solution of pure kelp waste in the same concentration，lC50of control experiment was 1.94mg/mL，while the lC50of polysaccharide from fermentation supernatant was 0.55mg/mL.At the 10mg/mL，the inhibition of superoxide anion was higher by 14.6%than from supernatant of solution of pure kelp waste in the same concentration.The totalantioxidantactivitywasincreased by 35.76% when the concentration of polysaccharide was 0.6mg/mL.The conclusion from the experiment was that the antioxidant capacity was increased evidently，and it was a scientific basis of the reusing of kelp waste with high value.

Hypsizigus marmoreus；liquid fermentation；kelp waste；polysaccharide；antioxidant activity

TS209

A

1002-0306（2011）02-0115-03

2010-10-28

解秋菊（1972-），女，本科，工程師，研究方向：食品微生物。