李永成，鐘秋平

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

甘蔗糖蜜預(yù)處理對產(chǎn)L-蘋果酸的影響與培養(yǎng)基N源添加

李永成，鐘秋平

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

研究了經(jīng)煮沸、活性炭、亞鐵氰化鉀、磷酸與硫酸預(yù)處理的糖蜜對黃曲霉生長與合成L-蘋果酸的影響以及培養(yǎng)基中N源添加。以經(jīng)各種預(yù)處理的糖蜜培養(yǎng)黃曲霉，其生物量大小分別是：硫酸法＞磷酸法＞亞鐵氰化鉀法＞活性炭法＞煮沸法。硫酸能有效除去糖蜜中影響菌體生長的膠體物質(zhì)，用硫酸處理的糖蜜作培養(yǎng)基時，其菌體生長量比煮沸處理高25%。用硫酸與亞鐵氰化鉀聯(lián)合處理，對L-蘋果酸合成最有利，其產(chǎn)酸達到59.6g/L。糖蜜培養(yǎng)基需添加1g/L硫酸銨為N源，較適培養(yǎng)基配方（g/L）為：糖120，NH4（SO4）21，K2HPO40.15，KH2PO40.15，CaCO370，pH5.5。

L-蘋果酸，甘蔗糖蜜，黃曲霉

L-蘋果酸是一種重要的有機酸，在醫(yī)藥、化工和食品工業(yè)上有著廣泛應(yīng)用。自然界中存在的蘋果酸都是L-蘋果酸，廣泛存在于水果和蔬菜中。與檸檬酸相比，L-蘋果酸的酸味別致，具有酸味柔和、爽快、刺激性緩慢、保留時間長的特點。以之調(diào)配出的食品、飲料更接近天然果汁風(fēng)味，是一種優(yōu)良的食品添加劑。在醫(yī)藥上，L-蘋果酸具有重要的生理功能，直接參與人體代謝；在印染、化工及其他工業(yè)，L-蘋果酸也具有廣闊的應(yīng)用前景。目前發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸的工藝主要有三類：一是糖質(zhì)原料一步發(fā)酵法［1-2］；二是兩步發(fā)酵法，即采用兩種不同功能的微生物，其中之一先將糖質(zhì)或其他原料轉(zhuǎn)化生成延胡索酸，另一種微生物再將延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸；三是以延胡索酸為原料的直接發(fā)酵法［3-4］。甘蔗糖蜜是南方糖廠的副產(chǎn)物，大部分用來生產(chǎn)酒精。研究以甘蔗糖蜜為原料，黃曲霉為生產(chǎn)菌，采用一步發(fā)酵工藝來生產(chǎn)L-蘋果酸，對提高甘蔗糖蜜的綜合利用與深度開發(fā)水平有一定實際意義。甘蔗糖蜜中含總糖量為50%～58%，膠體物質(zhì)為8%～10%。除此之外，糖蜜中還含有較多的B族維生素和多種氨基酸，其中每克甘蔗糖蜜約含生物素1～3μg，氨基酸總含量約為 0.3～0.5μg［5］。甘蔗糖蜜豐富的營養(yǎng)成分為L-蘋果酸生產(chǎn)菌黃曲霉的生長提供了良好的營養(yǎng)條件，但其中膠體物質(zhì)與金屬離子（Fe、Zn、Cu等）等雜質(zhì)會妨礙黃曲霉的生長與L-蘋果酸合成［6-7］，在發(fā)酵前需進行預(yù)處理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗糖蜜 海南那大糖廠提供（碳酸法糖蜜）；實驗試劑 均購自于上海醫(yī)藥集團公司，均為分析級試劑；標準品 L-蘋果酸 Sigma公司；黃曲霉（Aspergillus flavus） 本實驗室保存，從本校橡膠林土壤中篩選，經(jīng)紫外線、亞硝基胍（NTG）誘變獲得，能穩(wěn)定合成L-蘋果酸；培養(yǎng)基 試管斜面培養(yǎng)基采用麥芽汁培養(yǎng)基：4～5Be′麥芽汁，瓊脂15g/L，pH自然；種子培養(yǎng)采用麥芽汁培養(yǎng)基，不加瓊脂；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：糖蜜經(jīng)預(yù)處理后，稀釋至總糖濃度120，加NH4（SO4）21，K2HPO40.15，KH2PO40.15，CaCO370（單獨滅菌，接種前加入），pH5.5。

SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HYG-A全溫搖瓶柜 江蘇太倉實業(yè)設(shè)備廠；TGL-20M臺式冷凍高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；752紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；MP5002電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；DHG-9070A恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HP1100高效液相色譜儀 美國安捷倫。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖蜜預(yù)處理［7］

1.2.1.1 無處理（對照） 糖蜜用1∶1去離子水稀釋后，過濾，濾液供實驗。

1.2.1.2 煮沸法 糖蜜用1∶1去離子水稀釋后，加熱煮沸20min，過濾，濾液供實驗。

1.2.1.3 活性炭法 糖蜜經(jīng)1∶1去離子水稀釋后，加1%顆粒炭吸附處理，過濾，濾液供實驗。

1.2.1.4 亞鐵氰化鉀法 糖蜜用1∶1去離子水稀釋后，加0.1%亞鐵氰化鉀，調(diào)節(jié)酸堿度至pH6.5，煮沸30min后，同時加1%活性炭，過濾，濾液供實驗。

1.2.1.5 磷酸法 糖蜜用1∶1離子水稀釋后，加熱煮沸，加濃磷酸至pH2.0～3.0，靜置過夜，過濾，濾液加入新配制的石灰乳回調(diào)至pH6.0左右，65～70℃保溫30min，同時加1%活性炭，過濾，濾液供實驗。

1.2.1.6 硫酸法 糖蜜用1∶1去離子水稀釋后，加硫酸至pH2.0～3.0，后續(xù)操作與磷酸法相同。

1.2.1.7 硫酸與亞鐵氰化鉀聯(lián)合處理（硫酸+亞鐵氰化鉀）法 先用硫酸處理（硫酸法），然后加0.1%亞鐵氰化鉀，調(diào)節(jié)酸堿度至pH 6.5，同時加1%活性炭，攪拌30min，過濾，濾液供實驗。

1.2.2 黃曲霉的培養(yǎng) 糖蜜經(jīng)預(yù)處理后，添加其它成分與N源，500mL的三角瓶裝培養(yǎng)液100mL，發(fā)酵溫度35℃，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200r/min。N源及其添加量通過N源添加實驗來確定。

1.2.3 分析測定

1.2.3.1 總糖測定 直接取發(fā)酵液樣，采用硫酸-苯酚法。

1.2.3.2 總酸測定 采用酸堿滴定法。發(fā)酵結(jié)束后，用與70g碳酸鈣等當(dāng)量的硫酸中和，加熱10min，使蘋果酸充分游離出來，過濾，用蒸餾水重新定容至100mL，取濾液進行滴定。

1.2.3.3 膠體測定方法［8］用100mL量筒取已處理但未過濾糖液100mL，室溫靜置4h，以沉淀物所占體積表示（mL）。

1.2.3.4 菌體生物量測定 干重法，發(fā)酵液3000r/min離心10min，取菌絲體，70℃下干燥至恒重。

1.2.3.5 蘋果酸分析［6］采用HPLC法。色譜條件：色譜柱，XDB-C18（4.6×250mm，5μm）；流動相：0.5%磷酸二氫銨，pH 2.5，流速1mL/min；紫外檢測器，波長214nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖蜜預(yù)處理對糖質(zhì)量的影響

糖蜜中的膠體帶負電荷，其等電點偏酸性，用酸處理使膠體帶電荷為零而沉降，另外還可使部分金屬如Ca離子等沉淀。亞鐵氰化鉀法主要是除去Fe離子［9］，與酸處理比較，其對膠體的去除不理想。結(jié)果如表1，在單因素處理中，酸處理膠體去除率高，糖液清澈，色度低；煮沸法處理對膠體去除效果最差。

表1 不同處理對糖質(zhì)量的影響

2.2 糖蜜預(yù)處理對黃曲霉生長的影響

用經(jīng)不同預(yù)處理的糖蜜培養(yǎng)黃曲霉，各種預(yù)處理對黃曲霉生長的影響如圖1。在單因素處理中，煮沸法與活性炭法處理的菌體生長量均較低，硫酸法最高，硫酸法的最大生物量（17.48g/L）比煮沸法的（13.97g/L）要高25%，對于不同預(yù)處理的糖蜜，黃曲霉生物量大小依次為：硫酸法＞磷酸法＞亞鐵氰化鉀法＞活性炭法＞煮沸法＞對照；從黃曲霉平均耗糖速率來說，快慢順序依次為（表2）：硫酸法＞磷酸法＞亞鐵氰化鉀法＞活性炭法＞煮沸法＞對照，硫酸法明顯優(yōu)于活性炭法與煮沸法（P＜0.05），該順序與各處理的膠體去除率（表1）剛好一致，這說明膠體物質(zhì)會阻礙黃曲霉生長。而聯(lián)合處理中，硫酸法+亞鐵氰化鉀聯(lián)合處理對黃曲霉生長影響與硫酸法沒明顯區(qū)別（P＞0.05）。

圖1 糖蜜預(yù)處理對黃曲霉生長的影響

2.3 糖蜜預(yù)處理對產(chǎn)酸的影響

產(chǎn)酸情況（含量與純度）與菌種、培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件等有關(guān)。培養(yǎng)基成分要求既要能滿足黃曲霉生長的需要，又要含有產(chǎn)酸所需要的成分，如維生素、金屬離子，金屬離子對產(chǎn)酸影響很復(fù)雜［1-2］，不同離子種類與濃度對產(chǎn)酸與酸的種類都有影響，如有報道［2］，Mn2+對產(chǎn)L-蘋果酸有促進作用，而Cu2+卻有強烈抑制作用，F(xiàn)e2+則對雜酸特別是檸檬酸的產(chǎn)生有較大影響［7］。糖蜜有豐富的金屬離子［9-10］，亞鐵氰化鉀主要作用是絡(luò)合糖蜜的金屬離子。為了把酸去除膠體與鐵氰化鉀絡(luò)合金屬離子兩種作用結(jié)合起來，實驗采取了硫酸法+亞鐵氰化鉀聯(lián)合處理。與煮沸法、活性炭法比較，表3表明，亞鐵氰化鉀處理對L-蘋果酸含量與純度有一定的促進作用，而硫酸法+亞鐵氰化鉀法處理對L-蘋果酸含量與純度均有良好影響，這應(yīng)當(dāng)與兩種方法的復(fù)合效應(yīng)有關(guān)。

表2 糖蜜預(yù)處理對黃曲霉耗糖影響

表3 預(yù)處理對L-蘋果酸合成的影響

表4 N源對產(chǎn)酸的影響

2.4 糖蜜培養(yǎng)基對N源的選擇

糖蜜的含N量并不高（0.1%左右），要額外添加適當(dāng)?shù)腘才能滿足黃曲霉生長與產(chǎn)酸的要求。本實驗對N源的種類與量進行了實驗，結(jié)果如表4、表5。表4說明無機N源好于有機N源，實驗中發(fā)現(xiàn)有機N源耗糖速度慢，殘?zhí)歉摺Ｓ袡C氮源與無機N源結(jié)合使用時，效果不如無機N源單獨使用，這些可能與糖蜜有一定有機N源，不需另外添加有關(guān)。無機氮N以硫酸銨效果最好，表5對硫酸銨的添加量進行了實驗，表明硫酸銨的適合添加量在0.1%～0.15%。

表5 硫酸銨的添加量對蘋果酸產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論

糖蜜含有黃曲霉生長與L-蘋果酸合成的成分，但也含有一些抑制成分，如膠體物質(zhì)與金屬離子。膠體物質(zhì)明顯影響菌體的生長，金屬離子對L-蘋果酸合成的影響則比較復(fù)雜。糖蜜要經(jīng)預(yù)處理，去除膠體物質(zhì)與部分金屬離子，才能適合做L-蘋果酸合成的原料。實驗證明，硫酸與亞鐵氰化鉀聯(lián)合處理是種較適合的預(yù)處理方法，它能有效地去除大部分膠體物質(zhì)與部分金屬離子，滿足菌體生長與蘋果酸合成需要。糖蜜中N素較少，需額外添加。但糖蜜中生物素豐富，不需特別添加，前人實驗表明［2］，生物素能促進L-蘋果酸的合成。盡管本實驗得到的產(chǎn)酸量不是最高的，其成分對蘋果酸合成影響也需進一步深入研究，但糖蜜原料發(fā)酵與其它工藝相比，原料成本相對較低，因此它的大規(guī)模推廣有很大意義。

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Effects of cane molasses pre-treantment on L-malic acid production and N addition in medium

LI Yong-cheng，ZHONG Qiu-ping
（School of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China）

Effects of cane molasses pre-treated with boiling，active carbon，potassium ferrocyanide，phosphate and sulfate on L-malic acid production and Aspergillus flavus growth，and N addition in medium was studied.The biomass size order of Aspergillus flavus cultured with pre-treated cane molasses was by sulfate＞phosphate＞potassium ferrocyanide＞active carbon＞boiling.The colloidal substances were effectively removed by sulfate.The biomass of Aspergillus flavus cultured with cane molasses pre-treated by sulfate was 25%higher than that by boiling.lt was favorable for L-malic acid accumulation in Aspergillus flavus when the cane molasses was mixtreated with sulfate and potassium ferrocyanide，and L-malic acid accumulated to 59.6g/L.NH（4SO4）2of 1g/L was required in cane molasses medium，and the adaptive formula（g/L）was sugar 120，NH（4SO4）21，K2HPO40.15，KH2PO40.15，CaCO370，pH 5.5.

L-malic acid；cane molasses；Aspergillus flavus

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0178-03

2010-02-04

李永成，博士，從事微生物技術(shù)研究。

華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)科技基金資助（RND0420）。