徐艷霞，夏小環(huán)，劉世旺

(黃岡師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃州438000)

pH對(duì)氟羅沙星與BSA之間結(jié)合常數(shù)的影響

徐艷霞，夏小環(huán)，劉世旺

(黃岡師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北黃州438000)

采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法，通過測(cè)定在不同pH值、不同牛血清白蛋白濃度的緩沖溶液條件下藥物遷移時(shí)間的變化，計(jì)算出了pH分別為6.8、7.4和8.0時(shí)氟羅沙星與牛血清白蛋白相互作用的結(jié)合常數(shù)，其值分別為11.807 ×104、5.682 ×104、7.472 ×104mol/L。結(jié)果顯示:當(dāng) pH=6.8 時(shí)結(jié)合常數(shù)值最大，當(dāng) pH 增大為7.4時(shí)，結(jié)合常數(shù)值顯著下降。探討pH對(duì)結(jié)合常數(shù)的影響規(guī)律，對(duì)于進(jìn)一步闡明藥物作用機(jī)理具有較強(qiáng)的理論意義。

氟羅沙星;牛血清白蛋白;毛細(xì)管區(qū)帶電泳;結(jié)合常數(shù);pH

氟羅沙星(fleroxacin，F(xiàn)LRX)是1987年人工合成的第3代氟喹諾酮類抗菌素。由于其副作用小、口服吸收迅速完全、體內(nèi)分布范圍廣、藥物持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、血藥濃度高、對(duì)大多數(shù)需氧G－桿菌、葡萄球菌以及衣原體、支原體等均具有良好的抗菌活性，故其在臨床上使用廣泛，是一種常見的人獸共用抗炎藥［1－3］。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，它能與許多內(nèi)源及外源性化合物結(jié)合，起到存儲(chǔ)與轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。研究氟羅沙星與血清白蛋白之間的作用，有助于了解藥物分子在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布情況，對(duì)于闡明氟喹諾酮類藥物的作用機(jī)理、藥代動(dòng)力學(xué)等都有非常重要的意義［4－6］。

結(jié)合常數(shù)(Kb)是研究分子之間非共價(jià)相互作用的最重要參數(shù)之一，在生物化學(xué)及藥物學(xué)研究中，測(cè)定相關(guān)物質(zhì)之間的Kb、研究各種環(huán)境因素等對(duì)Kb的影響是一項(xiàng)很重要的工作。毛細(xì)管電泳(CE)是上世紀(jì)八十年代初發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù)，廣泛應(yīng)用于包括蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－核酸、蛋白質(zhì)－藥物、酶－底物、抗原－抗體等各種親和體系的分離和分析［7］。與傳統(tǒng)方法相比，CE法用于分子間相互作用的研究具有分析速度快，分離效率高，樣品用量少(nmol級(jí))，對(duì)受體的純度要求不高，在溶液中進(jìn)行，可以保持生物分子相互作用所需要的生理?xiàng)l件等優(yōu)點(diǎn)［8］。本文首次采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法，通過測(cè)定在不同pH值、不同牛血清白蛋白(BSA)濃度的緩沖溶液條件下藥物遷移時(shí)間的變化，計(jì)算出了不同pH值條件下氟羅沙星與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)，同時(shí)通過比較分析，探討了pH值影響結(jié)合常數(shù)的規(guī)律和內(nèi)在機(jī)理，這些對(duì)于進(jìn)一步闡明氟喹諾酮類藥物的作用機(jī)理并迅速開發(fā)出更高效的人獸兩用廣譜抗菌藥物具有較強(qiáng)的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氟羅沙星樣品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，BSA(MW=66000) 購(gòu)自 Sigma(St.Louis，MO，USA)，磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、丙酮等均為市售分析純?cè)噭?，水為二次去離子水。P/ACE 5000毛細(xì)管電泳儀(Beckman，USA)，紫外檢測(cè)器;未涂漬石英毛細(xì)管 50 μm i.d.×57 cm(有效長(zhǎng)度50 cm，河北永年光纖廠)。Varian CARY 1E紫外－可見光分光光度計(jì)(Australia)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件及操作步驟

電泳條件:溫度為20.0℃，冷凍液控溫;操作電壓為18 kV;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)間為10 s;兩次測(cè)定之間，將毛細(xì)管先用0.2 mol/L NaOH溶液沖洗6 min，再用去離子水沖洗2 min，隨后用運(yùn)行緩沖溶液沖洗3 min，然后進(jìn)樣。每份樣品均平行測(cè)定三次。

以不同pH值、50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液為運(yùn)行緩沖溶液，使用前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。氟羅沙星樣品先用濃鹽酸溶解，再加等體積pH=7.4的中性磷酸鹽緩沖溶液(PBS，100 mmol/L)稀釋，作為儲(chǔ)備液4℃冰箱冷藏備用。實(shí)驗(yàn)前用運(yùn)行緩沖溶液稀釋儲(chǔ)備液，使得氟羅沙星的濃度約為0.50 mmol/L;采用丙酮作為中性標(biāo)記物，樣品中丙酮的濃度約為0.2%(v/v);將BSA溶于運(yùn)行緩沖溶液中，分別配制成0.003、0.006、0.009、0.012、0.015、0.018 mmol/L 等系列濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳條件的優(yōu)化

為研究氟羅沙星在生理?xiàng)l件下(pH 6.0～8.0)與BSA的相互作用，同時(shí)綜合考慮到電滲流、電荷和離子強(qiáng)度等因素的影響，實(shí)驗(yàn)選擇了濃度為 50 mmol/L、pH 值分別為 6.8、7.4、8.0 的磷酸鹽緩沖體系。通過考察不同電壓下氟羅沙星電泳分離情況，并綜合考慮遷移時(shí)間和熱效應(yīng)等因素的影響后，我們選擇操作電壓為18 kV。將氟羅沙星稀釋至0.020 mmol/L左右后，在紫外－可見光分光光度計(jì)上掃描得到氟羅沙星的紫外吸收光譜(見圖1)。根據(jù)紫外吸收光譜和毛細(xì)管電泳儀性能指標(biāo)要求，我們選擇電泳檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

圖1 氟羅沙星紫外吸收光譜Fig.1 UV －Vis spectra of Fleroxacin

2.2 氟羅沙星與BSA間Kb測(cè)定

2.2.1 測(cè)定模型 為了簡(jiǎn)化計(jì)算，我們建立了一種簡(jiǎn)單模型，并假設(shè)藥物分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1∶1。將蛋白質(zhì)加入緩沖溶液中，藥物樣品進(jìn)樣后在毛細(xì)管區(qū)帶中與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，快速達(dá)到如下平衡:

其中Kb為藥物分子與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合常數(shù)，［M］和［P］分別為平衡體系中游離藥物和游離蛋白質(zhì)的濃度，［MP］為藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合而成的復(fù)合物的濃度。

Yang等［9］依據(jù)色譜原理，推導(dǎo)出以下線性方程:

其中k'為容量因子，Φ為相比(Vs/Vm)，s和m分別代表固相和液相。

k'可以根據(jù)方程(4)通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得到:

其中t為藥物的保留時(shí)間，t0為中性標(biāo)記物的保留時(shí)間。根據(jù)方程(3)作k'～［P］圖，直線的斜率為a，截距為b，結(jié)合常數(shù)Kb可通過方程(5)計(jì)算得到:

2.2.2 測(cè)定結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)以丙酮為中性標(biāo)記物，測(cè)定了在不同pH值、不同BSA濃度緩沖溶液條件下氟羅沙星的遷移時(shí)間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.02% ～1.1%之間，重現(xiàn)性很好，說明該方法準(zhǔn)確、可靠。根據(jù)模型中的方程(3)和(4)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，作k'～［BSA］圖，分別得到不同pH值條件下氟羅沙星與BSA相互作用的線性關(guān)系(見圖2)。應(yīng)用模型中的方程(5)計(jì)算出相應(yīng)的結(jié)合常數(shù)如表1。

圖2 不同pH條件下，k`和BSA濃度之間的線性關(guān)系圖Fig.2 The Linear relationship of k'and the concentration of BSA

表1 不同pH條件下，氟羅沙星與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)Table 1 The binding constants of the interactions between Fleroxacin and BSA

圖3 氟羅沙星與BSA相互作用的Kb和pH之間的關(guān)系圖Fig.3 Relationship between the binding constants and pH

氟羅沙星與BSA之間的結(jié)合常數(shù)隨pH值變化的趨勢(shì)情況如圖3。由圖3可見，在所研究的pH值范圍內(nèi)，氟羅沙星Kb的最大值出現(xiàn)在pH值為6.8時(shí)，當(dāng)pH值增大為7.4時(shí)，Kb值顯著下降，降幅超過50%，當(dāng)pH值再增大至8.0時(shí)，Kb值則略有增加，變化曲線整體上呈U形。2.2.3 討論 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氟羅沙星分子在不同pH條件下均能與BSA發(fā)生較強(qiáng)烈的相互作用，藥物與BSA之間的Kb均在104－105L/mol數(shù)量級(jí)。不同pH條件下氟羅沙星與BSA相互作用的線性相關(guān)系數(shù)r＞0.96，說明氟羅沙星分子與BSA之間結(jié)合比為1∶1以及藥物分子的保留行為與色譜過程中相似的假設(shè)是合理的，即氟羅沙星分子以1∶1的比例與BSA相互作用，分子結(jié)構(gòu)上存在單一確定的中心作用位點(diǎn)。

本小組對(duì)培氟沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等做過類似研究［10］。根據(jù)Kb值隨pH變化的情況推測(cè)，這四種藥物分子與BSA之間的結(jié)合力，在中性或偏堿性(pH7.4～8.4)時(shí)以范德華力為主，在微偏酸(pH=6.8)時(shí)以電荷作用力為主。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氟羅沙星與BSA之間的Kb值隨pH變化的規(guī)律與上述四種藥物分子非常相似，即pH=6.8時(shí) Kb值最大，pH 增至7.4時(shí)Kb值顯著減小。由此推測(cè)，在不同pH時(shí)氟羅沙星和BSA之間相互作用力的類型與上述四種分子相同，即在微偏酸時(shí)以電荷作用力為主，在中性或偏堿性時(shí)以范德華力為主。

氟羅沙星與培氟沙星等同屬氟喹諾酮類分子。在不同pH條件下，氟羅沙星和BSA之間相互作用的特點(diǎn)與其它四種藥物相似，這是它們分子骨架相同的結(jié)果(如圖4)。在一定pH條件下，氟羅沙星、培氟沙星等分子結(jié)構(gòu)中可能成為帶電荷的基團(tuán)主要有:羧基、酮基、氟原子及哌嗪基中的亞氨基。其中羧基和酮基在中性和偏酸性條件下易形成氫鍵，氫鍵的形成會(huì)使羧基和酮基的電荷量大大減少，基團(tuán)作用力也會(huì)相應(yīng)減弱，但實(shí)際測(cè)知氟羅沙星等的Kb值在微偏酸(pH=6.8)時(shí)均最大，由此可以推測(cè)，在中性和微偏酸環(huán)境中氟羅沙星與BSA作用的主要基團(tuán)不是羧基和酮基，而哌嗪基中的亞氨基則很可能處在作用位點(diǎn)的中心位置上。氟羅沙星與培氟沙星在分子結(jié)構(gòu)上的差異主要表現(xiàn)在氟原子個(gè)數(shù)上，而兩者Kb隨pH發(fā)生相似變化的規(guī)律表明:在藥物與BSA相互作用時(shí)，氟原子可能不在作用位點(diǎn)的中心。

圖4 氟羅沙星與培氟沙星的分子結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of Fleroxacin and Pefloxacin

3 結(jié)論

本文利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳，通過測(cè)定氟羅沙星的遷移時(shí)間，計(jì)算得到了pH分別為6.8，7.4和8.0時(shí)氟羅沙星與BSA之間的結(jié)合常數(shù)，其值分別為11.807 ×104、5.682 ×104、7.472 ×104L/mol。環(huán)境pH對(duì)氟羅沙星與BSA之間的相互作用有強(qiáng)烈影響，當(dāng) pH處在6.8－7.4之間時(shí)，結(jié)合常數(shù)對(duì)pH尤為敏感。同時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析推測(cè):氟羅沙星分子是以1∶1的比例與BSA相互作用的，分子結(jié)構(gòu)上存在單一確定的中心作用位點(diǎn);在pH6.8－7.4范圍內(nèi)，氟羅沙星與BSA之間的相互作用以電荷作用力為主，而在pH 7.4～8.0范圍內(nèi)，氟羅沙星與BSA之間的相互作用以范德華力為主。在藥物與BSA相互作用時(shí)，氟原子可能不在作用位點(diǎn)的中心。

［1］聶麗華，趙慧春，王學(xué)斌，等.熒光法研究氟羅沙星與牛血清白蛋白的相互作用［J］.北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2001，37(1):87 －91.

［2］何建鵬，李日生，劉厚凡，等.喹諾酮類藥物的發(fā)展概況［J］.江西化工，2007，(3):17－18.

［3］陳超森，曾卓，熊淑群.喹諾酮類藥物的研究進(jìn)展［J］.精細(xì)化工中間體，2005，35(5):1 －5.

［4］譚非，張勝建.氟羅沙星與人血清白蛋白相互作用研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2009，21(2):184－188.

［5］劉煒，畢和平，張連華，等.洛美沙星與 DNA相互作用的光譜研究［J］.海南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2008，21(3):282 －286.

［6］易平貴，俞慶森，商志才，等.氧氟沙星與牛血清白蛋白相互作用機(jī)制［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35(10):774－777.

［7］Tanaka Y，Terabe S.，Estimation of binding constants by capillary electrophoresis［J］.J Chromatogr B，2002，768:81－92.

［8］J.Otergaard，C.Schou，C.Larsen，N.H.H.Heegaard，Effect of Dextran as a Run Buffer Additive in Drug－Protein Binding Studies Using Capillary Electrophoresis Frontal Analysis［J］. Anal. Chem.，2003，75:207－214.

［9］Yang Y，Liu XX，Zhang X X，Korenaga T.Study on the Dynamic Complexation Between Protein and PAHs by Capillary Electrophoresis［J］.Anal Sci，2001，17:i1345－i1348.

［10］劉世旺，徐艷霞，夏小環(huán).pH對(duì)氟喹諾酮藥物與BSA之間相互作用影響的研究［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25(5):542 －546.

Influence of pH value on the interactions between fleroxacin and bovine serum albumin

XU Yan-xia，XIA Xiao-huan，LIU Shi-wang
(Chemistry and Life Science College，Huanggang Normal University，Huangzhou 438000，Hubei，China)

The interactions between fleroxacin(FLRX)and bovine serum albumin(BSA)were studied with capillary zone electrophoresis.The migration behaviors of FLRX were investigated in a series of running buffers containing different concentrations of BSA.The binding constants(Kb)of FLRX and BSA were calculated.As pH values of the running buffer were 6.8，7.4 and 8.0 respectively，Kbwas 11.807 ×104，5.682 ×104，and 7.472 ×104L/mol correspondingly.The results shows that pH value had a great influence upon the interactions between FLRX and BSA，and when pH value was equal to 6.8，Kbof FLRX and BSA had its maximum.Kbdecreased gradually when the pH value was 7.4.The binding type and site between FLRX and BSA were investigated in detail.Studying on the influence of pH value on the binding constants would be very helpful to explore the pharmacokinetic mechanism of the drug and develop its new derivatives.

fleroxacin;bovine serum albumin;capillary zone electrophoresis;binding constants;pH value

O657.8

A

1003-8078(2011)06-0061-04

2011-09-14 doi10.3969/j.issn.1003 －8078.2011.06.17

徐艷霞，女，湖北武漢人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事生理學(xué)的教學(xué)和科研工作。

劉世旺，男，湖北武漢人，教授，主要從事生物化學(xué)的教學(xué)科研工作。E－mail:swlsw@hgnu.edu.cn

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2008CDZ040);湖北省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(D20092706);湖北省產(chǎn)學(xué)研結(jié)合重點(diǎn)項(xiàng)目(C2010061)。

(李鑫)