閆子?jì)桑瑥堄辛?，于月?/p>

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

百里香揮發(fā)油成分分析及急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

閆子?jì)?，張有?，于月英

（陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062）

百里香全草是一味中藥，香味濃郁，在食品中多用作除膻調(diào)料，但其化學(xué)成分作用機(jī)理和毒理學(xué)特性尚不清楚。采用水蒸汽蒸餾法提取甘肅鎮(zhèn)原百里香揮發(fā)油，研究三種不同保藏方法保藏的百里香全草的揮發(fā)油提取得率，以冷凍保藏效果最好。同時(shí)利用GC-MS對(duì)甘肅鎮(zhèn)原百里香揮發(fā)油成分分析研究，分離出82個(gè)峰，并且確認(rèn)了52種化合物。通過(guò)對(duì)小鼠的急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，初步確定甘肅鎮(zhèn)原百里香揮發(fā)油的急性毒性致死量（LD）為4.00mL/kg和半致死量（LD50）3.02mL/kg。

百里香，揮發(fā)油，成分分析，GC-MS，毒理實(shí)驗(yàn)

百里香（Thymus serpyllum L.）［1］為唇形科百里香屬植物，在全世界約有300～400種，主要分布于地中海沿岸、非洲北部及亞洲溫帶地區(qū)。我國(guó)有12種［2］，主要分布于甘肅、陜西、青海、山西及河北，多生于海拔1100～3600m的黃土丘陵和沙地上。百里香植物是一味中藥，全株具有特殊芳香氣味，并且具有除膻作用，可作為制作香精和食用香料的重要原料。近年來(lái)，國(guó)外對(duì)百里香植物揮發(fā)油的研究較多［3］，并將其應(yīng)用于醫(yī)療、保健、化妝品、食品等方面。目前已分離出百里香揮發(fā)油成分最多至96種［4］，鑒定出揮發(fā)油成分最多至68種［5］。本文采用GC-MS法分析了我國(guó)甘肅省鎮(zhèn)原縣百里香揮發(fā)油的化學(xué)成分，并使用百里香揮發(fā)油對(duì)小鼠進(jìn)行了急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，為我國(guó)百里香資源的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百里香全草 采于甘肅省鎮(zhèn)原縣新城鄉(xiāng)，分別采用冷凍保藏（-18℃）、低溫保藏（5℃）、自然陰干三種方法儲(chǔ)存；小鼠 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心培養(yǎng)，昆明種小白鼠，出生45d，體重22～26g；鼠糧常規(guī)鼠糧。

提取設(shè)備 實(shí)驗(yàn)室自制蒸餾-冷凝裝置；分析儀器 HP6890GC/5973MSD氣-質(zhì)聯(lián)用分析儀（美國(guó)惠普公司），附G1701BA-B.0 1.00 ChemStation軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 百里香揮發(fā)油的提?。?］將冷凍保藏（-18℃）、低溫保藏（5℃）、自然陰干（室內(nèi)陰干）和新鮮全草（對(duì)照）四種百里香全草各取1000g，在實(shí)驗(yàn)室自制蒸餾-冷凝裝置的蒸餾鍋內(nèi)蒸餾1.0h，獲得1000mL蒸餾液，吸取蒸餾液中漂浮的揮發(fā)油，計(jì)算揮發(fā)油得率，計(jì)算公式為：

1.2.2 百里香揮發(fā)油的GC-MS分析條件［7-8］

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS，5%苯甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm× 0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：200℃；柱室溫度：60℃（保持5min），以 8℃/min升溫速率升至 150℃（保持10min）；載氣：高純氦氣；柱前壓 71kPa，流速lmL/min，分流比15∶1。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 接口溫度：280℃；電離方式：EI；電子能量：70eV；離子源溫度：250℃；四極桿溫度：130℃；調(diào)諧方式：標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧；質(zhì)量掃描方式：SCAN；溶劑延遲：1.5min；掃描范圍：10～550amu；電子倍增器電壓：1635V；G1033A，D.01.00NlST98標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫(kù)。

1.2.3 百里香揮發(fā)油的急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)［9］急性毒理實(shí)驗(yàn)［10］，是一次性投較大劑量后觀察動(dòng)物的變化，觀察期大約為2周，從而判定動(dòng)物的致死量（LD）和半致死量（LD50）。半致死量是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡一半的投藥量。如果投藥量大于5000mg/kg，無(wú)死亡，可認(rèn)為該品毒性較低，無(wú)需做致死量精確測(cè)定。

1.2.3.1 小鼠0%～100%致死用量預(yù)實(shí)驗(yàn) 選用西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心培養(yǎng)的昆明種小白鼠，出生45d，體重22～26g。將小鼠致死率0%～100%的劑量范圍初定為1.0～5.0mL/kg，實(shí)驗(yàn)小鼠按不同劑量分為5組，每組4只（雌雄各半），一次性灌胃，每組灌胃劑量為：1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL/kg。

1.2.3.2 百里香揮發(fā)油對(duì)小鼠急性毒理實(shí)驗(yàn) 使用改良寇氏法［11］，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將小鼠致死率0%～100%的劑量范圍初定為1.50～4.00mL/kg，實(shí)驗(yàn)小鼠按不同劑量分為8組，每組10只（雌雄各半），一次性灌胃。由，其中r為組距，b為100%致死劑量，a為0%致死劑量，n為組數(shù)，計(jì)算r≈1.15。根據(jù)r分組，每組灌胃劑量為：1.50、1.73、1.98、2.28、2.62、3.02、3.47、4.00mL/kg。

1.2.3.3 灌胃后觀察 給小鼠灌胃后每日觀察1次，觀察記錄在14d中毒表現(xiàn)、死亡數(shù)和死亡時(shí)間，得出LD（小鼠致死量）及LD50（小鼠半致死量）。對(duì)于死亡小鼠，解剖觀察其心、肝、脾、肺、腎和胃等主要器官的組織變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱(chēng)取存活小鼠并記錄體重，并處死尸檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保藏方法百里香揮發(fā)油的得率

經(jīng)蒸餾法提取測(cè)得不同保藏方法得率分別為：冷凍鮮藏全草0.21%，低溫鮮藏全草0.10%，自然干燥全草0.15%，對(duì)照（新鮮全草）0.22%。由此看出，冷凍保藏可以較好地保存百里香的揮發(fā)油，其原因可能是低溫減緩了香味物質(zhì)的揮發(fā)。

2.2 百里香揮發(fā)油的成分鑒定

取百里香揮發(fā)油0.2μL進(jìn)樣，進(jìn)行分離，得總離子流圖見(jiàn)圖1。將圖1中分離出的各組分提取質(zhì)譜圖經(jīng)用NIST98標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索并與文獻(xiàn)［12-14］核對(duì)，確認(rèn)了52種成分，采用氣相色譜面積歸一化法［15］確定了各種成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 百里香揮發(fā)油成分的總離子流色譜圖

分析鑒定結(jié)果表明，百里香揮發(fā)油中52種成分共占揮發(fā)油總量的98.51%，從所鑒定的52種成分中可見(jiàn)，其主要為香荊芥酚、百里香酚、香芹酮、龍腦、麝香草酚、異麝香草酚、2-亞甲基-4，8，8-三甲基-4 -乙烯基雙環(huán)［5，2，0］壬烷、醋酸百里酚酯等，其中香荊芥酚含量為24.42%，百里香酚含量為21.60%、香芹酮13.67%、龍腦9.04%。

2.3 百里香揮發(fā)油小鼠急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 急性中毒癥狀記錄 小鼠經(jīng)過(guò)量（5.00mL/kg）百里香揮發(fā)油灌胃后，出現(xiàn)下列癥狀：心跳加快，逐漸不規(guī)律，發(fā)出不正?？┛┞?，平衡性變差，走路搖擺，步伐不穩(wěn)，皮膚呈現(xiàn)不正常藍(lán)紫色（尾部血管尤為明顯），耳朵充血，眼球充血，四肢抽搐，行動(dòng)困難，呼吸停止。

2.3.2 致死量（LD）和半致死量（LD50） 從表2可知，大劑量百里香揮發(fā)油灌胃（3.47mL/kg體重）的結(jié)果導(dǎo)致小鼠的死亡率達(dá)到了80%，說(shuō)明百里香揮發(fā)油并非無(wú)毒，只有在≤1.73mL/kg體重的劑量時(shí)，才具有安全性。

表2 小鼠玫瑰精油灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由此可見(jiàn)，根據(jù)美國(guó)科學(xué)院毒性物質(zhì)等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)［16］（按物質(zhì)的半致死劑量LD50值劃分）：①“0”：無(wú)毒性，LD50＞15.0g·kg-1；②“1”：實(shí)際無(wú)毒性，5.0g·kg-1＜LD50＜15.0g·kg-1；③“2”：輕度毒性，0.5g·kg-1＜LD50＜5.0g·kg-1；④“3”：中度毒性，50.0mg·kg-1＜LD50＜500.0mg·kg-1；⑤“4”：毒性，LD50＜50.0mg·kg-1。天然的百里香揮發(fā)油是一種具輕度毒性的產(chǎn)品，毒性程度為2度。其 LD50為3.02mL/kg·DW，其LD值為4.00mL/kg·DW。

2.3.3 對(duì)主要臟器的影響 灌胃后24h內(nèi)小鼠出現(xiàn)輕微中毒癥狀，24h后，癥狀逐漸消失，至14d，處死所有未致死小鼠，解剖，觀察1號(hào)、2號(hào)組小鼠心、肝、脾、肺、腎和胃等臟器，未見(jiàn)有異常改變。

3 結(jié)論

經(jīng)研究，冷凍保藏（-18℃）可以最大限度地保存百里香全草的香氣物質(zhì)，可應(yīng)用于百里香的大批量貯藏加工。甘肅省鎮(zhèn)原縣百里香揮發(fā)油成分以酚、烯、酮、醇類(lèi)化合物為主，主要有香荊芥酚（24.42%）、百里香酚（21.60%）、香芹酮（13.67%）、龍腦（9.04%）、石竹烯氧化物（6.89%）、2-亞甲基-4，8，8-三甲基-4-乙烯基雙環(huán)［5，2，0］壬烷（6.06%）、麝香草酚（5.03%）、酸百里酚酯（4.37%）、醋大根香葉烯-D（4.21%）、異麝香草酚（4.15%）、香葉基丙酮（3.67%）、1-甲氧基-3-甲基-2-異丙基苯（3.56%）。經(jīng)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定百里香揮發(fā)油的LD為4.00mL/kg，LD50為3.02mL/kg，為低毒物品，可作為日用化工香精和食品添加劑原料。

表1 百里香揮發(fā)油主要化學(xué)成分及含量

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Study of composition and emergency toxicology test of thymus

YAN Zi-jiao，ZHANG You-lin*，YU Yue-ying
（College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Thymus is a traditional Chinese medicine with strong fragrance，which is usually used as seasoning wiping off rank odor in food.The chemical composition of its chemical composition and its toxicologic character are still not clear.The volatile oil in thymus collected in town of Zhenyuan in Gansu Province was extracted by means of wet distillation.After comparison of the yield from three different ways of preservation，the cryopreservation showed the best effect.GC-MS was used to analyze the ingredients in the volatile oil in thymus.82 peaks were separated and 52 kinds of compound were verified.The LD and LD50of volatile oil in Thymus was 4.00mL/kg and 3.02mL/kg through the research of acute toxicity test，respectively.

thymus；volatile oil；composition analysis；GC-MS；toxicological test

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0144-04

2010-01-19 *通訊聯(lián)系人

閆子?jì)桑?983-），女，研究方向：食品科學(xué)。