蘇文政 牛鐘相 張琳 朱榮生 韓紅

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一株新城疫病毒的分離鑒定及其F基因的克隆與序列分析

蘇文政①②牛鐘相①?gòu)埩闸谥鞓s生②韓紅②

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安 271018 ②山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 濟(jì)南）

本試驗(yàn)對(duì)山東某雞場(chǎng)發(fā)生疑似新城疫感染的肉雞分離得到的一株病毒，經(jīng)雞紅細(xì)胞血凝、血抑試驗(yàn)和動(dòng)物回歸試驗(yàn)，結(jié)果表明，該分離株為新城疫病毒。對(duì)其毒力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果MDT為55.6ｈ，ICPI為1.95，IVPI為2.85，表明該毒株為新城疫強(qiáng)毒株。PCR特異性擴(kuò)增NDV-SD-02的F基因，大小為1662bp，編碼553個(gè)氨基酸，F(xiàn)基因裂解位點(diǎn)氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，符合強(qiáng)毒株氨基酸序列的特點(diǎn), 與生物學(xué)特性測(cè)定的結(jié)果完全相符。對(duì)分離株F基因的序列分析表明，與近年來(lái)國(guó)內(nèi)外分離得到的Ⅶ型NDV同源性較高，為84.7%~98.9%，該毒株屬基因Ⅶ型。

新城疫病毒 生物學(xué)特性 F基因 序列分析

新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的禽類一種急性、敗血性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為對(duì)畜禽危害最大的A類傳染病之一[1]，其病原—NDV屬于副粘病毒科禽腮腺炎病毒屬，為有囊膜的負(fù)鏈RNA病毒[2]。NDV基因組為單股不分節(jié)RNA，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，其中融合蛋白(F)和血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)為NDV的功能性糖蛋白，F(xiàn)蛋白能夠促進(jìn)病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜的融合，蛋白裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列對(duì)病毒的毒力有著非常重要的影響，被看作判定NDV毒力的重要標(biāo)準(zhǔn)[3]。此外，根據(jù)F基因的高變區(qū)序列將NDV劃分為不同的基因型[4]。一直以來(lái)，新城疫都危害禽類養(yǎng)殖，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，所以本研究從山東某雞場(chǎng)分離到新城疫病毒，對(duì)其生物學(xué)特性和致病性進(jìn)行了分析，并對(duì)F基因進(jìn)行了研究，旨從分子水平闡明各毒株間的異同，為該病的防控及分子流行病學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 病料分離自山東某規(guī)?；怆u場(chǎng)發(fā)病雞群。SPF雞胚及SPF雛雞由山東省農(nóng)科院家禽研究所提供。

1.2 主要試劑 Trizol購(gòu)于Invitrogen公司；M-MLV、Rnase Inhibitor、ExDNA聚合酶、pMD18-T Vector、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker DL2000均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖袨镻romega公司產(chǎn)品。新城疫La Sota株標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(HI效價(jià)為為2-10)，禽流感(H5和H9)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，EDS-76陽(yáng)性血清均購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所。1%雞紅細(xì)胞和滅菌生理鹽水由本研究室按照常規(guī)方法制備。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登陸的雞源NDV F基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)特異性引物，用于擴(kuò)增F基因。引物由上海生工合成，序列U1:5’-ATGGGCTCCAAACC TTCTACCAG-3’ L2: 5’-TCGCCCT TTTGTAGTGGCTCTC ATC -3’。

1.4 病毒分離與鑒定 無(wú)菌采集發(fā)病雞的氣管、脾臟和肝臟等組織制成勻漿，按1:4加入滅菌生理鹽水制成懸液，反復(fù)凍融3次(-70℃/37℃)，8000r/min離心10min，取上清加青鏈霉素至2000IU/ml，置4℃冰箱過(guò)夜。后經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚10枚，0.2ml/胚，石蠟封口后置37℃孵化器中孵化，每日照蛋2次，收集24h~72h的死胚及72h的存活胚尿囊液，再用10日齡SPF雞胚連續(xù)盲傳2代收集雞胚尿囊液保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 尿囊液血凝抑制試驗(yàn) 按照新城疫微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)操作規(guī)程檢測(cè)病毒分離株血凝特性。根據(jù)HA效價(jià)，配制成4IU病毒，分別與NDV、禽流感病毒(H5、H9)及EDS-76的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)。

1.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將新鮮雞胚尿囊液10倍稀釋，經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼途徑攻毒10只30日齡左右的SPF雞，0.5ml/只。觀察雞群變化。

1.7 病毒生物學(xué)特性測(cè)定 按照2001年版《中華人民共和國(guó)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定方法，進(jìn)行最小致死量雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)、1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)及6周齡SPF雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)測(cè)定。

1.8 F基因的RT-PCR擴(kuò)增與序列分析 （1）病毒RNA提取。參照Trizol試劑盒使用說(shuō)明提取病毒RNA，最后用20ul RNase Free H2O溶解RNA，-80℃凍存?zhèn)溆?。?）F基因的RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系中加入5×RT Buffer 2ml，dNTP 1ml，Rnase Inhibitor 0.25ml，M-MLV 0.5ml，RNA模板5ml，隨機(jī)引物2ml，混勻后瞬時(shí)離心甩至管底，PCR儀中42℃反應(yīng)90min，然后70℃ 15min。PCR反應(yīng)體系為50ml：cDNA 8ml，10×PCR Buffer 5ul，dNTP 4ml，F(xiàn)1 1ml，F(xiàn)2 1ml，ddH2O 32ml，95℃ 5min后，冰浴2min，再加Ex酶1ml，混勻后按下列條件PCR擴(kuò)增：94℃變性1min，55℃退火1min，，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。取10ml PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。（3）F基因PCR產(chǎn)物的克隆及序列測(cè)定將RT-PCR特異性產(chǎn)物F基因回收后與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中，篩選獲得陽(yáng)性克隆菌株并進(jìn)行酶切及PCR鑒定后，送至大連寶生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。（4）F基因的序列分析：利用DNAMAN和Genetyx等軟件，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接和序列分析，并將其與其它毒株進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離與鑒定 將病料接種雞胚后，所接雞胚在72h內(nèi)逐漸死亡，尿囊液清亮透明，死亡雞胚水腫，全身出血，尤以頭部和爪子明顯。所測(cè)HA效價(jià)在2-6~2-8之間，將其尿囊液盲傳2代后可穩(wěn)定在2-9。將HA為2-9的尿囊液與ND陽(yáng)性血清、AI-H5、AI-H9單因子血清、EDS-76標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該病毒能被ND陽(yáng)性血清所抑制，而不能被其他3種血清所抑制。結(jié)果表明分離到的毒株為新城疫病毒，將其命名為NDV-SD-02。

2.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 5只被攻毒的SPF雞48后均食欲下降、精神萎靡，并有明顯呼吸道癥狀，攻毒后4d內(nèi)全部死亡，剖檢可見喉頭、氣管黏膜充血，腸道出血，腺胃尤其嚴(yán)重，實(shí)質(zhì)性器官腫大，皮膚出血潰瘍，為典型新城疫癥狀。采集病料處理后接種雞胚，培養(yǎng)后收取尿囊液，做HI試驗(yàn)，結(jié)果與自然病例相符，也具有血凝性且能被ND標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清中和。

2.3 MDT、ICPI、IVPI測(cè)定結(jié)果 按照毒力判定標(biāo)準(zhǔn)，表明該新城疫分離株為強(qiáng)毒型，詳見表1。

表1 新城疫NDV-SD-02株的毒力指標(biāo)

2.4 NDV-SD-02分離株F基因的RT-PCR擴(kuò)增與序列分析 （1）F基因擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的鑒定。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示產(chǎn)物大小為1662bp，與預(yù)期相符。隨后采用pMD18-T載體與F基因連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，用IPTG/X-gal瓊脂平板藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取白色菌落，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定得到1662bp片段，表明成功獲得了NDV-SD-02株 F基因的重組克隆質(zhì)粒，命名為pMD18-T/NDV-F。（2）測(cè)序結(jié)果與序列分析。測(cè)序結(jié)果顯示，F(xiàn)基因開放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)為1662bp，編碼553個(gè)氨基酸，含有12個(gè)半胱氨酸殘基(分別位于25、76、199、338、347、362、370、394、399、401、424、523氨基酸殘基處)和6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)(Asn-x-Thr/Ser，NXT/S)(分別位于85、191、366、447、471、541氨基酸殘基處，第1個(gè)位點(diǎn)在F2多肽上，其余均在F1多肽上)，裂解位點(diǎn)處氨基酸組成為112Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe117，具有NDV強(qiáng)毒株的典型分子特征，這與生物學(xué)特性測(cè)定的結(jié)果完全相符。（3）同源性分析。將NDV-SD-02株與國(guó)內(nèi)外近年來(lái)分離到的NDV強(qiáng)毒株和弱毒株進(jìn)行F基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示核苷酸同源性為84.7%~98.9%，氨基酸同源性為88.8%~98.9%，其中與傳統(tǒng)的F48E9、La Sota毒株相比，核苷酸和氨基酸同源性分別為84.96%~87.1%和89.3%~91.7%，同源性較低，而與Ⅶ型NDV同源性較高。（4）系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹：根據(jù)NDV F基因有代表性的區(qū)域(1-347bp)對(duì)分離株進(jìn)行基因分型，并應(yīng)用DNAMAN和Mega3繪制遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示分離株處于Ⅶ型基因型分支，獲得的分離株為基因Ⅶ型。

圖1 根據(jù)F基因1-374bp核苷酸序列繪制的遺傳進(jìn)化樹(方框?yàn)榉蛛x株NDV-SD-02)

3 討論

NDV只有1個(gè)血清型，但不同毒株對(duì)雞的致病性不同，一般分為3個(gè)類型：速發(fā)型病毒株(包括速發(fā)嗜內(nèi)臟型、速發(fā)嗜神經(jīng)型和速發(fā)嗜肺型)、中發(fā)型病毒株和緩發(fā)型病毒株[5]。判斷1株NDV病毒屬于哪一致病型常需測(cè)定3個(gè)指示，即最小致死量雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)、1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)及6周齡SPF雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)。其中以ICPI最為關(guān)鍵，IVPI可作為參考。本研究中MDT、ICPI、IVPI毒力檢測(cè)分別為55.6h、1.95、2.85，表明分離株NDV-SD-02屬?gòu)?qiáng)毒株。此外根據(jù)人工感染雞臨床癥狀，毒株為速發(fā)嗜內(nèi)臟型。

F蛋白是NDV感染細(xì)胞所必需的，它能夠促進(jìn)病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合。研究表明，NDV強(qiáng)毒株F蛋白裂解位點(diǎn)為112R-R-Q-R/K-R-F117，本研究分離得到的NDV-SD-02株F蛋白裂解位點(diǎn)序列為112R-R-Q-K-R-F117，屬于NDV強(qiáng)毒，這一結(jié)果也與致病力測(cè)定結(jié)果(MDT、ICPI、IVPI)相符。

19世紀(jì)80年代以來(lái)在世界各地分離出NDV的基因Ⅶ型。我國(guó)近20年流行的NDV也主要為基因Ⅶ型，但也有較老的基因II型和Ⅲ、Ⅵ、Ⅸ等型[6]。本研究中分離的病毒株與近年來(lái)分離得到的NDV病毒株相比，核苷酸同源性為84.7%~98.9%，其中與F48E9、La Sota毒株相比核苷酸和氨基酸同源性分別為84.96%~87.1%和89.3%~91.7%，同源性低，而與與Ⅶ型NDV同源性較高，在進(jìn)化樹中也與Ⅶ型同處一分支。

目前，我國(guó)主要采用Maktesuar(I系)、LaSota(Ⅳ系)等疫苗對(duì)家禽進(jìn)行免疫[7]，但研究結(jié)果表明，分離株與疫苗株同源性較低，交叉免疫效果有限，這可能是造成免疫效果不佳的原因之一。所以需要篩選與流行株密切相關(guān)的病毒作為候選疫苗株，為家禽養(yǎng)殖提供更有效的防治措施，這也要求進(jìn)一步做好新城疫病毒的流行病學(xué)調(diào)查，從而有效控制新城疫的發(fā)生。

[1] Mayo M A, A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV [J]. Arch Virology, 2002,147:1655~1656.

[2] Chambers P, Millar N S, Bingham R W,. Molecular cloning of complentary DNA to Newcastle disease virus, and nucleotide sequence analysis of the junction between the genes encoding the haemagglutinin-neuraminidase and the large protein [J]. Journal of General Virology, 1986,67:475~486.

[3] Anthony,Hodder,Pawl w. Analysis of pathotype-specific structural features and clesvage activation of Newcastle disease virus membrane glycoprotein using antipeptide [J]. Journal of General Viro:74,1081-1091,1993.，

[4] Nagai Y, Klenk HD. Proteolytic cleage of the viral glycoproteins and its significance for the virulenc of Newcastle disease virus [J]. Virology 72:494-508,1976).

[5] 劉懷然, 孫敏華等. 不同宿主源NDV毒株對(duì)SPF雞致病性研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2009(2).

[6] 吳艷濤, 倪雪霞, 萬(wàn)洪全等. 我國(guó)部分地區(qū)不同動(dòng)物來(lái)源新城疫病毒的分子流行病學(xué)研究[J]. 病毒學(xué)報(bào), 2002, 18(3): 264-269.

[7] 孫杰, 刁有祥等. 10株鴨源新城疫病毒的分離鑒定及F基因遺傳進(jìn)化分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2010, 41(8):1054-1060.

（2011–03–21）

S852.65+9

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1007-1733(2011)04-0005-03