梁俊昌 許瑞利 朱瑞良

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豬2型圓環(huán)病毒自家組織滅活苗的研制及其免疫效果觀察

梁俊昌①②許瑞利①②朱瑞良①

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安 271018 ②山東省棗莊市市中區(qū)畜牧獸醫(yī)局）

本試驗(yàn)通過檢測(cè)細(xì)胞組織培養(yǎng)PCV2滅活疫苗與自家細(xì)胞免疫后PCV2抗體水產(chǎn)，結(jié)果表明，自家組織滅活苗是預(yù)防PCV2行之有效的辦法。

PCV2 自家組織滅活菌 免疫

豬2型圓環(huán)病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)病是當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)流行的傳染病之一，在現(xiàn)代化規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)中，PCV2往往與其他疫病混合感染[1]，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。該病的廣泛流行和蔓延已給世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅和經(jīng)濟(jì)損失[2]。本試驗(yàn)對(duì)自家組織苗在某些豬場(chǎng)應(yīng)用的效果進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料和方法

1.1 材料

滅活疫苗-藍(lán)圓二聯(lián)苗(某高等院校研究所中試產(chǎn)品)；自家組織苗：選試驗(yàn)豬場(chǎng)PCV2發(fā)病豬典型間質(zhì)性肺炎病料，嚴(yán)格按自家組織苗制作程序制作，經(jīng)0.4%甲醛滅活，恒溫汽浴振蕩培養(yǎng)箱37℃滅活36h，冷藏備用；圓環(huán)病毒2型抗體檢測(cè)試劑盒；美國(guó)伯樂公司680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.2 方法與步驟

1.2.1 分組和預(yù)試 42日齡健康豬45頭，隨機(jī)分為A、B、C3組，每組15頭，分3欄飼養(yǎng)，每組按1~15的順序逐頭打耳缺編號(hào)，觀察7d，無異常，正式試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)前采血和初免 試驗(yàn)豬49日齡，3個(gè)組同時(shí)逐頭前腔靜脈采血5ml，隨即頸部肌肉注射相應(yīng)疫苗或生理鹽水：A組(試驗(yàn)I組)每頭免疫試驗(yàn)用藍(lán)圓二聯(lián)苗3ml；B組(試驗(yàn)II組)每頭免疫試驗(yàn)用自家組織苗3ml；C組(對(duì)照組)每頭注射生理鹽水3ml。所采血樣常溫析出血清，按分組對(duì)應(yīng)編號(hào)標(biāo)記，-20℃冷凍保存待檢。

1.2.3 初免抗體檢測(cè)采血和二免 試驗(yàn)豬70日齡采血，試驗(yàn)組逐頭免疫相同種類和劑量的疫苗，對(duì)照組仍每頭注射生理鹽水3ml。所采血樣析出血清，編號(hào)保存。

1.2.4 二免抗體檢測(cè)采血 試驗(yàn)豬91日齡，全部試驗(yàn)豬逐頭前腔靜脈采血5ml，所采血樣依上述1.2.2和1.2.3析出血清，編號(hào)保存。

1.2.5 抗體檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析 把所采血清，逐份ELISA檢測(cè)PCV2抗體，血清抗體OD值依分組編號(hào)逐頭登記。按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較各組方差及OD均值差異顯著性。

1.2.6 試驗(yàn)豬群觀察 試驗(yàn)開始后，逐日觀察各試驗(yàn)組和對(duì)照組群體的生長(zhǎng)、采食、發(fā)病情況及外觀表現(xiàn)，以判斷不同疫苗對(duì)PCV2的免疫效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2抗體的檢測(cè)結(jié)果和統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)各組不同階段PCV2抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果表1。為從統(tǒng)計(jì)學(xué)上判斷各組免疫前后抗體水平變化是否存在差異，對(duì)各組不同階段的抗體水平逐對(duì)作成對(duì)雙樣本均值分析t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果如表2。

表1 各試驗(yàn)組與對(duì)照組免疫的不同階段PCV-2抗體檢測(cè)結(jié)果

表1、表2數(shù)據(jù)顯示：試驗(yàn)I組經(jīng)藍(lán)圓二聯(lián)滅活苗1次免疫21d后，血清抗體陽(yáng)性率從40.00%上升至79.31%，OD均值上升，但與一免前差異不顯著。2次免疫21d后，陽(yáng)性率從79.31%上升至100%，OD均值進(jìn)一步上升，且與二免前差異極顯著。試驗(yàn)II組經(jīng)自家組織苗1次免疫21d后，陽(yáng)性率從56.66%上升至100%，OD均值上升，與1免前差異極顯著。2次免疫21d后，陽(yáng)性率仍是100%，OD均值繼續(xù)上升，且與2免前差異極顯著。

表2 PCV2血清抗體檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

2個(gè)試驗(yàn)組分別經(jīng)2次藍(lán)圓二聯(lián)苗和自家組織苗免疫后，血清PCV2抗體水平都能有效上升。雖然從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度，試驗(yàn)I組一免21d后與一免前血清抗體水平對(duì)比，差異不顯著，但其抗體陽(yáng)性率及OD均值都有明顯提高或上升(OD均值由0.153上升至0.3062)，且P(|t|>tα/2)＝0.0729，已經(jīng)很接近H0的拒絕域(0.025)，尚不能據(jù)此否認(rèn)該組一免21d后血清抗體水平顯著上升。要確知抗體是否顯著上升，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

對(duì)照組經(jīng)1次注射生理鹽水21d后，血清抗體陽(yáng)性率從70%下降至56.67%，OD均值下降，但與1次注射生理鹽水前差異不顯著。2次注射生理鹽水21d后，抗體陽(yáng)性率進(jìn)一步下降到53.33%，但OD均值卻有所上升，且與2次注射生理鹽水前差異極顯著。不能把這一抗體水平顯著上升歸因于注射生理鹽水。因OD均值上升的同時(shí)，抗體陽(yáng)性率卻進(jìn)一步下降，OD均值的上升，不是總體普遍上升的結(jié)果，而是個(gè)別樣本超常上升的影響。這種結(jié)果，可能與個(gè)別試驗(yàn)樣本PCV2自然感染有關(guān)。

2.2 免疫效果觀察

試驗(yàn)II組(自家組織苗免疫組)豬群從初次免疫開始，到20周齡，生長(zhǎng)一直正常，與該場(chǎng)正常豬無異。試驗(yàn)I組(藍(lán)圓二聯(lián)苗組)和對(duì)照組(生理鹽水組)從12周齡開始，逐漸表現(xiàn)出與該場(chǎng)未使用自家組織苗免疫以前豬群散發(fā)性PCV2流行期間完全相同的癥狀。直到15周齡補(bǔ)注射自家組織苗，17周齡加強(qiáng)免疫1次；并在每次注射苗前3d開始，連續(xù)7d飼料中添加抗生素協(xié)助預(yù)防和治療，豬群才開始逐步恢復(fù)正常。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在市場(chǎng)未有免疫效果確切的PCV2疫苗銷售以前，采集自場(chǎng)病豬典型間質(zhì)性肺炎病料制作自家組織苗，仍是預(yù)防PCV2行之有效的辦法。豬群經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)PCV2制作的滅活苗免疫后，PCV2抗體顯著上升，但不能有效預(yù)防PCV2發(fā)病。說明PCV2的結(jié)構(gòu)蛋白抗體，不能有效預(yù)防PCV2發(fā)病。自家組織苗中含有PCV2與其他病原或有機(jī)微粒融合體這一可能性外，還可能有以下2種原因：（1）PCV2寄生靶細(xì)胞問題。PCV2與HIV(愛滋病毒)具有很大的相似性，都是在免疫細(xì)胞內(nèi)寄生和復(fù)制。HIV疫苗之所以20多年至今仍未研制成功，除了因?yàn)镠IV存在頻繁變異外，還因?yàn)樗纳谌梭w免疫細(xì)胞，其中和抗體無法有效突破免疫細(xì)胞固有的免疫屏障，中和在細(xì)胞內(nèi)寄生的HIV。傳統(tǒng)疫苗通過激發(fā)免疫細(xì)胞的免疫方式，對(duì)HIV免疫沒有任何效果[3]。（2）病毒。細(xì)胞系統(tǒng)分泌蛋白對(duì)病毒的免疫作用：已有的研究證實(shí)，昆蟲的桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，可高水平表達(dá)外源蛋白—多角體蛋白，這些蛋白覆蓋并保護(hù)著核體內(nèi)的病毒粒子。通過提純這種蛋白，可對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生一定的免疫源性。使用間質(zhì)性肺炎病料制作自家組織苗之所以能較好地預(yù)防PCV2發(fā)病，也可能因?yàn)镻CV2感染肺泡細(xì)胞后，刺激肺泡細(xì)胞產(chǎn)生某種分泌蛋白，這種分泌蛋白對(duì)PCV2具有某種保護(hù)作用，或者促進(jìn)其在機(jī)體內(nèi)復(fù)制。機(jī)體經(jīng)這種分泌蛋白免疫后，能有效中和這種分泌蛋白[4]，從而抑制PCV2在機(jī)體內(nèi)復(fù)制，或使PCV2在機(jī)體內(nèi)失去保護(hù)屏障，無法在細(xì)胞內(nèi)生存，使PCV2不發(fā)病。

[1] 孫艷明, 趙德明. 豬圓環(huán)病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2006, 33(7): 62-64.

[2] 陳艷紅,郭鑫,趙榮茂,等.我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)主要繁殖障礙性病毒病的血清學(xué)調(diào)查[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志,2007,43(6):33-35.

[3] 胡蘭銀, 張騫, 肖建鋒等. 引起豬發(fā)病死亡主要疫病的病原學(xué)調(diào)查[J]. 畜禽業(yè), 2007,32(12):15-17.

[4] 邱艷紅, 吳峻華, 葉瑋等. 福州市豬圓環(huán)病毒(PCV-2)血清學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2005, 41(8): 26-27.

（2011–03–23）

S852.5+2

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1007-1733(2011)04-0013-02