?；蹚?李 慧 王佳賀 張 萌 張 毅 何 平

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科,沈陽 110004)

Rho GDI2與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在肺癌細(xì)胞中的相關(guān)性研究

?；蹚?李 慧 王佳賀 張 萌 張 毅 何 平＊

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科,沈陽 110004)

目的 探討腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子Rho GDI2與 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及相關(guān)機(jī)制。方法 利用PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路上特異性的抑制劑,采用MTT法,傷口愈合實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度藥物對(duì)肺癌95D細(xì)胞生長侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響,通過Western Blot方法觀察RhoGDI2蛋白水平的變化。結(jié)果 PI3K抑制劑L Y294002及mTOR抑制劑Rapamycin都能抑制肺癌細(xì)胞95D的侵襲轉(zhuǎn)移能力,聯(lián)合應(yīng)用抑制作用更強(qiáng)。PI3K抑制劑L Y294002處理組RhoGDI2蛋白的表達(dá)量增加,且隨濃度增加RhoGDI2蛋白表達(dá)也增加。mTOR抑制劑Rapamycin組,在低濃度時(shí)增加RhoGDI2蛋白的表達(dá),但增大Rapamycin的濃度,RhoGDI2蛋白的表達(dá)反而降低。低濃度L Y294002組和Rapamycin組聯(lián)合應(yīng)用可以明顯增加Rho GDI2蛋白的表達(dá)。結(jié)論 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中Akt的活化與RhoGDI2密切相關(guān),RhoGDI2可能直接或間接通過與Akt的相互作用參與調(diào)節(jié)肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移的過程。

肺癌; RhoGDI2; PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路; 侵襲; 轉(zhuǎn)移

肺癌是當(dāng)今世界上嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤,每年有超過一百萬的人死于肺癌?，F(xiàn)在的治療包括手術(shù)、放化療等?；熾m然改善非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)病人的生存率,然而5年存活率仍較低。最近幾年,已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道了磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常與腫瘤生長,維持和化療耐藥等方面有關(guān)[1]。

Rho GDI2是最初在膀胱癌上確定的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子,其在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。目前對(duì)Rho GDI2轉(zhuǎn)移相關(guān)功能的研究主要聚焦在Rho/Rac在胞漿與漿膜的活性調(diào)節(jié)上?；?PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用,我們?cè)O(shè)想 RhoGDI2蛋白是否與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)?因此我們利用PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路上特異性的抑制劑,通過Western Blot等方法來觀察RhoGDI2蛋白水平的變化。

材料和方法

1.細(xì)胞系和主要試劑

人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系95D購于中科院上海細(xì)胞研究所。兔抗人Rho GDI2抗體購自ABCAM公司,兔抗人 GAPDH抗體購自 Santa Cruz生物技術(shù)公司;蛋白 Marker購自 Promega公司;ECL試劑盒購自Amershma公司。PRMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于 Hyclone公司,胰蛋白酶購自Gibco公司;MTT液和二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma公司。Rapamycin和 L Y294002購自 Sigma公司。Transwell趨化小室 (孔徑 8.0μm)購于Costar公司;基質(zhì)膠 Matrigel購于BD Biosciences公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

人肺癌細(xì)胞系95D生長于含10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基中,內(nèi)加 100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素 ,置于 37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),2-3 d傳代一次。細(xì)胞呈貼壁生長。

L Y294002處理組:5μmol/L 組;20μmol/L 組;50μmol/L 組。

Rapamycin處理組:10nmol/L組;20 nmol/L組;40 nmol/L組

聯(lián)合處理組:L Y 5μmol/L +R 10nmol/L組;L Y 10μmol/L+R 10nmol/L組

2.2 細(xì)胞增殖測(cè)定實(shí)驗(yàn)(MTT法)

采用MTT法,取對(duì)數(shù)生長期的95D細(xì)胞,調(diào)整懸液濃度為1×105/ml,每孔200μl接種于無菌的96孔培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同的處理因素,對(duì)照組不加藥,另設(shè)空白對(duì)照孔。每組設(shè)3個(gè)平行孔。繼續(xù)培養(yǎng),48h后加入MTT(5g/L)20μl,放置孵箱內(nèi)4h后棄上清加入150μl的二甲基亞砜(DMSO),震蕩15min,用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處的各孔吸光光度值(OD值)。

經(jīng)過四五年探索，檢查預(yù)約中心涉及的檢查項(xiàng)目涉及10個(gè)科室35個(gè)檢查項(xiàng)目，包括胃鏡、腸鏡、支氣管鏡、CT、核磁共振、超聲、PET/CT、ECT、動(dòng)態(tài)心電圖、動(dòng)態(tài)血壓等。

2.3 傷口愈合實(shí)驗(yàn)

生長旺盛的95D細(xì)胞以0.25%胰酶消化、培養(yǎng)液洗滌終止消化后,用含10%胎牛血清培養(yǎng)液配制1×106/ml的95D細(xì)胞懸液,按每孔2 ml加入6孔板,37℃、5%CO2培養(yǎng)24h,使細(xì)胞貼壁。吸棄孔中液體,PBS液沖洗1遍;用10μl槍頭在孔中劃一直線后,用PBS液再?zèng)_洗2次;加入含不同濃度處理組的含10%小牛血清培養(yǎng)液(2ml/孔),以等量無藥培養(yǎng)液為對(duì)照,37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)每2h觀察1次,直至劃痕被細(xì)胞填滿。同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 侵襲實(shí)驗(yàn)(Boyden小室法)

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入 Transwell小室,將10.4mg/ml的 Matrigel膠用 4℃培養(yǎng)液稀釋(1∶3),在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel 60μl,置于37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。制備單細(xì)胞懸液,在上室中每室加入4×105個(gè)細(xì)胞(200μl),下室中加入500μl含20%FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液;每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)24h后,用棉簽擦去基質(zhì)膠和上層膜面細(xì)胞,穿過基底膜的細(xì)胞黏附于膜下層,無水乙醇固定30min,結(jié)晶紫染色5min,用蘸水棉簽擦凈上室,手術(shù)刀片小心裁下膜,以附有細(xì)胞的一面貼附于載玻片,膜干燥后滴加中性樹膠封片鏡檢。200倍光鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞,每膜計(jì)算5個(gè)視野,取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 Western Blot

取2×105個(gè)細(xì)胞,加300μ1蛋白裂解緩沖液,反復(fù)吹吸,4℃靜置 1h,低溫高速離心 (4℃,13000r/m,30min),取上清?？捡R斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量,每管 50μg蛋白分裝。將裂解產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)印至 PVDF膜,配制一抗稀釋液 Rho GDI2(1∶200),GAPDH(1∶15000),將條帶用 TTBS略加清洗后分別放入一抗稀釋液中,搖床上室溫雜交2h,辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5000)搖床上室溫雜交1h后,ECL法顯色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用BIO-RAD凝膠電泳圖像分析儀進(jìn)行采圖,Quantity One軟件包分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗(yàn);組間比較采用單因素方差分析;當(dāng) P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MTT法檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路上的抑制劑對(duì)肺癌細(xì)胞系95D生長的影響

PI3K抑制劑L Y294002抑制95D細(xì)胞的生長,隨著濃度增加,抑制作用逐漸增加;mTOR抑制劑Rapamycin抑制95D細(xì)胞的生長,隨著濃度增加,細(xì)胞破壞及細(xì)胞碎片增加,抑制作用也逐漸增加(見圖1)。

圖1 不同藥物處理組對(duì)肺癌95D細(xì)胞增殖的影響Fig.1 MTT assays were performed on 95D cells in the presence of different PI3K/Akt/mTOR antagonists.

2.傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路上的抑制劑對(duì)肺癌細(xì)胞系95D遷移運(yùn)動(dòng)能力的影響

因?yàn)榭紤]到高濃度的 PI3K抑制劑L Y294002和mTOR抑制劑Rapamycin對(duì)細(xì)胞的生長有抑制作用,細(xì)胞增殖數(shù)量的減少必然延長細(xì)胞劃痕愈合時(shí)間,所以我們僅選取了低濃度的 5μmol/L L Y294002組,與對(duì)照組相比,5μmol/L Y294002組可明顯抑制95D細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力;10nmol/L組Rapamycin組與對(duì)照組相比,也可以明顯抑制95D細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力。聯(lián)合應(yīng)用L Y294002和Rapamycin可以增強(qiáng)對(duì)95D細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)的抑制作用(見圖2)。

圖2 倒置顯微鏡下觀察不同處理組培養(yǎng)24h后95D細(xì)胞傷口愈合情況Fig.2 Wound healing assay was carried out with A. Untreated 95D cells;B.in the presence of 10nmol/L Rapamycin;C. in the presence of 5μmol/L L Y294002;and D. in the presence of 5μmol/L L Y294002+10nmol/L Rapamycin.

3.Boyden小室法檢測(cè) PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路上的抑制劑對(duì)肺癌細(xì)胞系95D侵襲能力的影響

與對(duì)照組比較,PI3K抑制劑L Y294002 5μmol/L組和mTOR抑制劑Rapamycin 10nmol/L組明顯減弱肺癌細(xì)胞95D的侵襲能力,聯(lián)合應(yīng)用明顯增強(qiáng)對(duì)侵襲能力的抑制。差異具有顯著性意義(P<0.05)(見圖 3)。

圖3 不同處理組培養(yǎng)24h后侵襲細(xì)胞數(shù)Fig.3 Cell invasion assays were performed on 95D cells in the presence of different PI3K/Akt/mTOR antagonists.

4.不同干預(yù)因素對(duì)Rho GDI2蛋白表達(dá)的影響

PI3K抑制劑L Y294002增加Rho GDI2蛋白的表達(dá),且隨濃度增加 Rho GDI2蛋白表達(dá)增加。mTOR抑制劑Rapamycin,在低濃度時(shí)增加Rho GDI2蛋白的表達(dá),但增大 Rapamycin的濃度,Rho GDI2蛋白的表達(dá)反而降低。低濃度L Y294002和Rapamycin聯(lián)合應(yīng)用可以明顯增加Rho GDI2蛋白的表達(dá)(見圖4)。

圖4 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路上抑制劑對(duì)RhoGDI2蛋白表達(dá)的影響1.L Y 5μmol/L+R 10nmol/L 組 ;2.L Y 10μmol/L+R 10nmol/L 組;3.L Y294002 5μmol/L 組 ;4.L Y294002 20μmol/L 組 ;5.L Y294002 50μmol/L 組;6.Rapamycin 10nmol/L 組;7.Rapamycin20nmol/L 組;8.Rapamycin 40nmol/L組Fig.4 Effects on RhoGDI2 expression in 95D treated with PI3K/Akt/mTOR antagonist. A. The expression levels of Rho GDI2 as examined via Western blot and B.charted results from A. 1. L Y294002(L Y)5μmol/L+Rapamycin(R)10 nmol/L;2. L Y 10μmol/L+R 10 nmol/L;3. L Y 5μmol/L;4. L Y 20μmol/L;5. L Y 50μmol/L;6. R 10 nmol/L;7. R 20 nmol/L;8. R 40 nmol/L.

討 論

Rho GDI2作為與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子,最初被認(rèn)為是膀胱癌的[2,3]轉(zhuǎn)移抑制基因。但是具體的調(diào)節(jié)機(jī)制和信號(hào)通路尚不清楚。隨后的進(jìn)一步研究又發(fā)現(xiàn),Src蛋白可能與Rho GDI2蛋白相互作用以行使其調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移抑制的功能[4-6]。但也有學(xué)者認(rèn)為RhoGDI2不是轉(zhuǎn)移抑制基因,而可能是癌基因,其表達(dá)促進(jìn)腫瘤的生長,侵襲及轉(zhuǎn)移。雖然Rho GDI2在腫瘤中的作用存在爭(zhēng)議,但是在研究過程中得出的很多結(jié)果卻很相似,如學(xué)者都提出Rho GDI2與 RacGTPase相結(jié)合而起作用,而 Rac作為分子開關(guān)在不同細(xì)胞類型和不同腫瘤環(huán)境中也起著雙重作用,可以促進(jìn)腫瘤生長或是起到抑制作用[7],一些學(xué)者認(rèn)為這也許也是研究結(jié)論不同的原因之一,但是之間的確切關(guān)系仍然很不清楚。

Rho GDI2作為與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的因子,在肺癌細(xì)胞系,肺癌組織的具體作用機(jī)制,國內(nèi)外研究較少。那么在肺癌中是否存在Rho GDI2的表達(dá)?它對(duì)肺癌細(xì)胞又會(huì)起到怎樣的調(diào)節(jié)作用呢?我們?cè)谇捌诘墓ぷ髦衃8],結(jié)果表明Rho GDI2蛋白在大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)降低,且與組織分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);但是在肺癌細(xì)胞系中都有表達(dá),表達(dá)水平不盡相一致。Rho GDI2在肺癌組織中表達(dá)量存在差異,在選用的肺癌細(xì)胞系中都有一定程度的表達(dá),由此我們推想與Rho GDI2相關(guān)的下游信號(hào)通路,在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中,可能被某種未知的可逆轉(zhuǎn)的機(jī)制所阻斷。因此在進(jìn)一步研究中我們聚焦可能與 Rho GDI2進(jìn)行“Cross Talk”并參與肺癌進(jìn)程的信號(hào)通路。

Akt活化程度的增加見于惡變前和惡變的人類支氣管上皮細(xì)胞,在正常細(xì)胞中沒有表達(dá),而且藥物誘導(dǎo)凋亡的能力與 Akt活化水平的增加相關(guān)[9]。此外,在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者切除的腫瘤組織中,通過免疫組織化學(xué)方法可以分析檢測(cè)到高水平Akt磷酸化表達(dá),并可提示Akt的活化與疾病進(jìn)展有關(guān)。我們利用 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路上特異性的抑制劑,來觀察Rho GDI2蛋白水平的變化。我們的研究發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑L Y294002增加Rho GDI2蛋白的表達(dá),且隨濃度增加 RhoGDI2蛋白表達(dá)增加;mTOR抑制劑 Rapamycin,在低濃度時(shí)增加Rho GDI2蛋白的表達(dá),但增大Rapamycin的濃度,Rho GDI2蛋白的表達(dá)反而降低;低濃度L Y294002和 Rapamycin聯(lián)合應(yīng)用可以明顯增加Rho GDI2蛋白的表達(dá)。

基于以上的研究,我們可以推論 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路與Rho GDI2之間有潛在的相互作用。PI3K抑制劑L Y294002可以抑制Akt的磷酸化和活化,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,從而抑制腫瘤的生長和侵襲轉(zhuǎn)移;對(duì)于 mTOR抑制劑 Rapamycin,其抑制下游S6K的活化從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。但是近年學(xué)者發(fā)現(xiàn)Rapamycin可以反饋性的活化Akt,其機(jī)制可能是 Rapamycin和它的具有相似作用的藥物,僅能夠抑制 mTOR-raptor復(fù)合體(TORC1)的活性,而對(duì) mTOR-rictor復(fù)合體(TORC2)沒有作用[10-12],TORC2能夠使 Akt 473位絲氨酸磷酸化活化Akt[13]。因此,Rapamycin可能改變細(xì)胞內(nèi)mTOR復(fù)合體的平衡狀態(tài),并且通過mTOR-rictor復(fù)合體的作用促進(jìn)Akt的磷酸化;O’Reilly等人[14]的研究表明mTOR抑制劑誘導(dǎo)上游受體酪氨酸激酶信號(hào)通路,從而活化Akt。這也許就是 mTOR抑制劑 Rapamycin,在低濃度時(shí)增加Rho GDI2蛋白的表達(dá),但增大 Rapamycin的濃度,Rho GDI2蛋白的表達(dá)反而降低的原因。

在研究中,我們利用PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑,發(fā)現(xiàn)明顯抑制Akt活化的因素則增強(qiáng)Rho GDI2蛋白的表達(dá)。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中Akt的活化與 Rho GDI2密切相關(guān),Akt的活化與RhoGDI2蛋白的表達(dá)成負(fù)相關(guān)。Rho GDI2可能直接或間接通過與Akt的相互作用參與調(diào)節(jié)肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移的過程。

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R elationship betw een RhoG DI2 and PI3K/Akt/mTORsignalling pathw ay in lung cancer cells

Niu Huiyan,Li Hui,Wang Jiahe,Zhang Meng,Zhang Yi,He Ping＊

(Department of Geriatrics,Shengjing Hospital,China Medical University,Shenyang110004,China)

Objective To investigate the effects of Rho GDI2 and PI3K/Akt/mTOR on invasion and metastasis of lung cancer,and the possible interplay between PI3K/Akt/mTOR pathway and RhoGDI2 signalling in 95D lung cancer cells.Methods Effects of PI3K/Akt/mTOR antagonists on 95D lung cancer cell growth,mobility and invasion were measured by MTT assay,wound healing assay and cell invasion assay. The expression of Rho GDI2 protein was detected by Western blot. Results Either or both PI3K/Akt/mTOR antagonists inhibited 95D lung cancer cell growth,invasion and metastasis.The expression of Rho GDI2 protein was decreased in the 30 ng/ml rhHGF group,while it was increased in L Y294002 groups and Rapamycin 10nmol/l and 20 nmol/l groups.The expression of Rho GDI2 protein was decreased in the Rapamycin 40nmol/l group.Combination of L Y294002 and Rapamycin increased Rho GDI2 expression significantly.Conclusion Rho GDI2 has a close relationship with the activation of Akt by the PI3K/Akt/mTOR signalling pathway.Rho GDI2 may be directly or indirectly involvd in the invasion and metastasis of lung cancer by its interaction with Akt.

Lung cancer; RhoGDI2; PI3K/Akt/mTOR signalling pathway; Invasion; Metastasis

R734.2

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.001

2010-09-29

2011-03-18

遼寧省科技計(jì)劃資助(2009225008-10)

?；蹚?女(1977年),漢族,主治醫(yī)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)