方長清 唐 娜 楊青松李 淼王業(yè)林李建華

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科及中國醫(yī)科大學病理教研室,沈陽 110001;1撫順市第四醫(yī)院放射科,撫順 113123;2遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院病理科,沈陽 110034)

RhoC和 Ki67在非小細胞肺癌中的表達及意義

方長清 唐 娜 楊青松1李 淼2王業(yè)林李建華＊

(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科及中國醫(yī)科大學病理教研室,沈陽 110001;1撫順市第四醫(yī)院放射科,撫順 113123;2遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院病理科,沈陽 110034)

目的 探討RhoC、Ki67在非小細胞肺癌中的表達狀況及其與臨床病理學參數(shù)間的關系。方法 利用免疫組織化學(ElivisionTMplus法),檢測肺癌組織芯片中151例非小細胞肺癌患者RhoC、Ki67的表達情況。結果 肺癌組織的RhoC蛋白陽性表達率為59.60%(90/151),相應癌旁組織 RhoC陽性表達率為32.7%(16/49),差別有顯著意義(P<0.05)。RhoC在TNM III/IV期的NSCLC組織中陽性表達率為68.9%(51/74),明顯高于在Ⅰ/II期NSCLC組織中陽性表達率50.6%(39/77,P<0.05);RhoC在出現(xiàn)淋巴結轉移的表達率為49.2%(32/65),顯著高于沒有淋巴結轉移的陽性表達率67.4%(58/86,P<0.05);非小細胞肺癌中 RhoC高表達同 Ki-67高表達呈顯著正相關關系(χ2=21.634,r=0.377,P<0.01)。結論 RhoC的高表達與非小細胞肺癌的分期,淋巴結轉移及增殖有關。

RhoC; Ki67; 非小細胞肺癌; 侵襲轉移

肺癌是目前全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤,每年新發(fā)病例數(shù)接近100萬,約占癌癥發(fā)病總數(shù)的12%,居各種惡性腫瘤之首,且呈逐年上升趨勢,患者總的5年生存率僅為8%-11%[1]。導致肺癌患者預后不良的主要原因在于肺癌患者在發(fā)現(xiàn)時往往已經處于晚期,出現(xiàn)了癌細胞的淋巴結轉移,甚至轉移至遠隔器官。因此,充分揭示肺癌細胞的侵襲轉移機制,對于降低肺癌患者的死亡率,具有重要意義。

Ras相似蛋白C(Ras homology C,RhoC)是小分子量G蛋白超家族中Rho亞族的成員蛋白之一,近年研究表明RhoC在多種腫瘤中高表達,尤其在轉移方面的作用突出,被稱為腫瘤侵襲轉移的分子開關[2]。本研究利用免疫組化的方法,檢測組織芯片中151例非小細胞肺癌患者RhoC的表達情況,同時選用能比較客觀反映腫瘤細胞增殖活性的Ki67抗原(Ki67 antigen),來探討 RhoC和 Ki67在肺非小細胞肺癌中的表達狀況及其與臨床病理參數(shù)之間的關系。

材料和方法

1.肺癌組織芯片

組織芯片(共200點,組織切片直徑約2mm,切片厚度4μm)購自上海生物芯片有限公司。其中男性68例,女性83例,年齡39-78歲,中位年齡62.94歲。151例為非小細胞肺癌組織(按照新WHO標準(2004),80例腺癌,71例鱗癌),另外49例為對應的正常肺組織。按2009年國際抗癌協(xié)會(UICC)制定的 TNM分期:Ⅰ期31例,II期46例,III期71例,IV期3例。有淋巴結轉移86例,無淋巴結轉移65例。

2.主要試劑

羊抗人 RhoC多克隆抗體(SC212116,美國Santa Cruz公司);鼠抗人單克隆抗 Ki-67抗體(即用型)、免疫組化 ElivisionTMplus試劑盒(KIT-9901)及DAB顯色劑購自福州邁新公司。

3.Elivision TM plus法檢測 RhoC和 Ki-67的表達

參照試劑說明書分別檢測RhoC和 Ki-67的表達,組織芯片脫蠟至水,高溫高壓抗原修復,ElivisionTMplus法過氧化物酶阻斷液孵育10 min,第一抗體 RhoC,工作濃度1/50;抗人單克隆抗體 Ki-67(即用型),4℃冰箱過夜;DAB顯色,蘇木精輕微襯染。同時用PBS代替一抗作染色的陰性對照,用已知的染色陽性切片作陽性對照。

4.結果判斷

RhoC以細胞漿和/或細胞核呈棕黃色者為陽性細胞,選腫瘤細胞陽性染色集中區(qū)域每張切片技術高倍視野(×400)下400個腫瘤細胞。按 RhoC表達百分率分為以下四個等級:<25%為0分,26%-50%為1分,51%-75%為2分,>75%為3分。根據免疫組化染色強度分為三個等級:淺黃色計為1分,棕黃色計為2分,黃褐色計為3分。以陽性細胞率和染色強度的分值乘積作為每一例的積分。為便于統(tǒng)計分析,將評分結果歸為陰性表達(積分<3分者)和陽性表達(積分≥3)兩組。

Ki-67以細胞核呈棕黃色者為陽性細胞,觀察5個視野(×200)中 Ki-67表達的腫瘤細胞占的百分比,取其均值<30%的癌細胞表達為低表達,≥30%的癌細胞表達為高表達。

5.統(tǒng)計學處理

采用醫(yī)學統(tǒng)計軟件 SPSS11.5進行統(tǒng)計分析,RhoC、Ki-67在組織中陽性表達率比較采用χ2檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.RhoC在NSCLC及癌旁組織中的表達情況

RhoC蛋白的陽性表達部位主要在細胞的胞質或胞核(見圖1)。NSCLC組織的 RhoC陽性表達率為59.60%(90/151),相應癌旁組織RhoC陽性表達率為 32.7%(16/49),差別有顯著意義(P<0.05)。

圖1 免疫組織化學檢測RhoC在肺癌組織芯片中的表達情況A.經過免疫組織化學(ElivisionTMplus法)染色后肺癌組織芯片;B.RhoC在肺鱗狀細胞癌中高表達;C.RhoC在肺腺癌中高表達;Rho C高表達的肺腺癌(D)伴隨著 Ki67的高表達(E)。Fig.1 The expression of RhoC in NSCLC tissue array by immunohistochemistryA.The RhoC expression in NSCLC tissue array detected by immunohistochemical staining(ElivisionTMplus method,×10);B.High expression of RhoC in squamous cell carcinoma of lung;C.High expression of RhoC in lung adenocarcinoma;High expression of RhoC in adenocarcinoma(D)is correlated with High expression of Ki67(E).

2.RhoC在NSCLC的表達與臨床病理特征之間的關系

如表 1所示,RhoC在 TNM III/IV期的NSCLC組織中陽性表達率為68.9%(51/74),明顯高于在Ⅰ/II期NSCLC組織中陽性表達率50.6%(39/77,P<0.05);RhoC在出現(xiàn)淋巴結轉移的表達率為49.2%(32/65),顯著高于沒有淋巴結轉移的陽性表達率 67.4%(58/86,P<0.05);RhoC表達與性別、年齡、部位、腫塊大小和分化程度無明顯相關性。

表1 RhoC在NSCLC中的表達及與臨床病理特征的關系Table 1 The expression and clinical pathological significance of RhoC in NSCLC

3.RhoC的表達與核增殖抗原 Ki-67之間的關系

如表2所示,經χ2檢驗分析,非小細胞肺癌中RhoC高表達同 Ki-67高表達呈顯著正相關關系(χ2=21.634,r=0.377,P<0.01)。

表2 RhoC的表達與核增殖抗原 Ki-67的關系Table 2 The relationship of RhoC and Ki-67 expression in NSCLC

討 論

RhoC是小 GTP激酶家族的重要成員,主要參與肌動蛋白細胞骨架的構建、以及細胞增殖、游走等生命過程,并在細胞周期調控及包括基因轉錄在內的許多事件中起關鍵作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)RhoC在多種腫瘤,如如浸潤性乳腺癌、前列腺癌、頭頸部鱗癌、肝癌中高表達,并參與了細胞惡性轉化、浸潤轉移和血管發(fā)生[4-7]。

本研究應用免疫組織化學方法檢測了151例組織芯片中非小細胞肺癌及癌旁肺組織中RhoC的蛋白表達,發(fā)現(xiàn)RhoC蛋白在肺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁肺組織,提示高表達的 RhoC蛋白可能與肺癌的進展關系密切;而RhoC高表達與肺癌的淋巴結轉移、腫瘤臨床分期顯著相關,這可能是由于RhoC的高表達活化了相關的下游蛋白,使得肌動蛋白收縮絲組裝并與粘著斑復合物結合,增強了細胞的運動能力,最終導致肺癌細胞的向淋巴結轉移。

Ki67是一種貫穿表達于增殖期細胞的核抗原,其表達于除 G0及 G1早期外的其它各期,其表達變化能比較客觀地反映腫瘤細胞的增殖活性。Wang H等人的研究結果表明[8],應用siRNA技術干擾結腸癌細胞系中RhoC的表達后顯著抑制了腫瘤細胞的增殖能力。為了從蛋白水平研究RhoC與肺癌細胞增殖的關系,本實驗通過聯(lián)合檢測RhoC、Ki67在非小細胞肺癌中的表達,首次探討RhoC在肺癌中的表達是否與細胞增殖有關。結果顯示肺癌組織中RhoC與 Ki67的高表達存在明顯相關性(r=0.377,P<0.01),提示 RhoC可能參與細胞周期的調控而促進腫瘤細胞的增殖,說明RhoC的高表達參與肺癌的發(fā)展過程。但是RhoC促進細胞增殖的機制及參與調控細胞增殖的途徑目前還不十分清楚。

綜上所述,RhoC的過度表達在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用,可能由于RhoC的過表達,使肺癌細胞獲得了更強的增殖和運動能力,從而促進肺癌的惡性生物學行為。

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Expression and clinical significance of RhoC and ki-67 in non-small-cell lung cancer

Fang Changqing,Tang Na,Yang Qingsong1,Li Miao2,Wang Yelin,Li Jianhua＊

(Department ofPathology,China Medical University and Department ofPathology,The First A f f iliated Hospital of China Medical University,S henyang,110001;1Department of Radiology,The Forth Hospital ofFushun,Fushun113123;
2Department ofPathology,The Second A f f iliated Hospital of L iaoning Tradition China Medical University,S henyang,110034,China)

Objective To explore the expression and significance of RhoC,Ki-67 in non-smallcell lung cancer.Methods The expressions of RhoC and Ki-67 in 151 specimens of lung cancer were detected by immunohistochemistry in tissue microassay.Results The expression of RhoC was detected in 90 of the 151(59.60%)human lung cancer tissues,significantly higher than that in normal lung tissues,which was only in 16 of the 49 cases(32.7%). The positive expression of RhoC was higher in advanced TNM stages(III+IV)of NSCLC,than in lower stages(I+II)(P<0.05).A correlation between RhoC expression and lymph node metastasis was found in our study(P<0.05). Besides,we also found that the overexpression of RhoC was positively correlated with Ki67 in NSCLC(χ2=21.634,r=0.377,P<0.01). Conclusion The overexpression of RhoC is correlated with advanced TNM stage,lymph nodal metastasis and proliferative ability of NSCLC.

RhoC; Ki67; Non-smallcell lung cancer; Invasiveness

R743.2

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.012

2010-11-15

2011-02-01

遼寧省科學技術廳資助 (20082077)

方長清,男(1968年),漢族,副主任技師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)