高 鯤，張紅城，董 捷*

(中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093)

復合蛋白酶酶解油菜蜂花粉及其表征

高 鯤，張紅城，董 捷*

(中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093)

蜂花粉營養(yǎng)成分豐富，并多存在于花粉粒內(nèi)部，花粉壁的存在限制了蜂花粉的開發(fā)和利用。結(jié)果表明：采用復合蛋白酶處理花粉，獲得最佳破壁效果時的條件為：pH8、48℃、時間48h。并在此條件下利用比表面積、粒度分析、Zeta電位、掃描電鏡、透射電鏡對蜂花粉破壁進行表征評定，從不同角度反映酶法在改善花粉細胞通透性上起到的作用。

蜂花粉；復合蛋白酶；破壁；表征評定

蜂花粉是蜜蜂從蜜源植物花蕊內(nèi)采集的花粉粒，經(jīng)過蜜蜂向其內(nèi)部加入了花蜜和分泌物，混合成不規(guī)則扁圓形、上面帶有蜜蜂后肢嵌挾痕跡的團狀物[1]?；ǚ壑邪ǖ鞍踪|(zhì)、碳水化合物、不飽和脂肪酸、維生素、礦物成分等多種功能營養(yǎng)物質(zhì)[2-4]，因此有很高的營養(yǎng)價值，被人們稱為“全能營養(yǎng)庫”[5]，延緩衰老、抗疲勞、美容、防治心腦血管疾病、增強胃腸功能等作用[6]。

蜂花粉的內(nèi)容物被耐酸、耐堿、耐腐蝕的堅硬外壁以及內(nèi)壁包裹著[7]，外壁主要由孢粉素和纖維素構(gòu)成，內(nèi)壁主要含有纖維素和果膠[8]?；ǚ郾诘拇嬖谧璧K了人體對蜂花粉內(nèi)部營養(yǎng)成分吸收利用，因此需要對蜂花粉進行破壁處理，以提高人們食用花粉時對其營養(yǎng)成分的吸收利用率，另外，當蜂花粉被添加到化妝品、口服液、保健酒等高新產(chǎn)品中，由于皮膚沒有消化吸收功能，液態(tài)產(chǎn)品又不能帶有花粉壁，則必須對花粉進行合適的破壁處理。

現(xiàn)在使用的花粉破壁方法主要分為物理方法、化學方法、生化方法[9]，并常用“破壁率”這一單一指標對破壁效果做出評價。目前，缺乏科學有效的評定蜂花粉破壁情況的表征方法。本實驗采用處理條件溫和的酶解方法，并首次采用比表面積、粒度分析、Zeta電位、掃描電鏡、透射電鏡等指標對花粉破壁情況進行科學全面的表征評定，完善蜂花粉破壁方法和破壁評價體系，有利于揭示破壁前后蜂花粉生理功能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花粉 中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所；復合蛋白酶諾維信公司；蒸餾水；硫酸鉀、硫酸銅、碳酸鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ASAP 2010比表面積分析儀 天津市達因儀器廠；QUANTA 200掃描電鏡 美國FEI公司；H-T7650透射電鏡 日本Hitachi公司；MASTERSIZER 2000激光粒度分析儀 英國馬爾文公司；DelsaNano C Zate電位儀 美國貝克曼公司；LGJ-18S冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太合市實驗設(shè)備廠；Kjeltec 2200半自動凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理[10]

將油菜蜂花粉研磨均勻，準確稱取1.0g左右蜂花粉放入100mL三角瓶，然后向瓶中加入約20mL蒸餾水。試驗中的每個水平做4個樣，兩個空白樣品，兩個加酶樣品。

1.3.2 酶解

根據(jù)均勻設(shè)計表中設(shè)計的試驗數(shù)據(jù)，調(diào)節(jié)各三角瓶中花粉液至相應(yīng)pH值，分別為5.5、6、6.5、7、7.5、8，再加入0.1g左右的復合蛋白酶后移至搖床中，分別在45、50、55℃條件酶解24h或48h 。

1.3.3 均勻試驗設(shè)計[11]

試驗中的pH值、溫度和時間等因素都對改善蜂花粉細胞通透性有影響，為了分析這3個因素以及各因素間的相互作用對酶解的影響，利用DPS軟件設(shè)計了均勻試驗設(shè)計表1。

表1 均勻試驗設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in uniform design

1.3.4 蛋白溶解指數(shù)的測定[12]

將處理好的花粉液以2500r/min離心20min，棄除上清液，收集沉淀，并放入真空干燥箱中干燥。準確稱量0.1g左右干燥后的樣品進行凱氏定氮，用于蛋白溶解指數(shù)測定。

1.3.5 比表面積測定

破壁后花粉粒的比表面積測定采用BET法[13]。將處理好的花粉液以2500r/min離心20min，棄除上清液，收集沉淀，放入真空冷凍干燥箱中干燥。準確稱量一定量的樣品加入到比表面積儀的稱量管中，經(jīng)ASAP 2010軟件分析得出比表面積值。

1.3.6 粒度測定[14]

將5mL處理后的花粉液以2500r/min離心10min，去除上清液，用10mL蒸餾水溶解沉淀，重新離心去上清，再次溶解沉淀。將復溶的懸濁液加入激光粒度分析儀測定液中，利用低功率氦-氖激光器測定液體中花粉的粒度。

1.3.7 Zeta電位的測定[15]

經(jīng)過處理后的花粉液以2500r/min離心10min，取上清液加入電位儀樣品池，根據(jù)DelsaNano軟件操作得出相應(yīng)的Zeta電位值。

1.3.8 掃描電鏡觀察

處理后花粉液經(jīng)2500r/min離心20min，取沉淀干燥成粉末狀后，取少量均勻固定于樣品臺的膠帶上，再放入離子測射裝置鍍金90s，將制備好的樣品送入掃描電鏡中抽真空，后將電鏡調(diào)至適當倍數(shù)后觀察。

1.3.9 透射電鏡觀察

將酶解后的花粉進行包埋處理，之后將包埋好的樣品進行超薄切片，用眉毛筆把切片撈至銅網(wǎng)上，將銅網(wǎng)放至濾紙上干燥備用，干燥好后放入透射電鏡的樣品室觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法對蜂花粉蛋白溶解指數(shù)的影響

表2 均勻試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Uniform design and corresponding experimental results

如表2所示，利用DPS軟件進行多元逐步回歸方差分析，軟件將根據(jù)輸入的數(shù)據(jù)生成一個多元二次方程，方程如下：Y1＝73.6967246－19.714835466X1＋2.4019897367X2＋1.0990100000X12－0.028048100001X22－0.012 2 9 0 6 5 0 1 2 9X32＋0.0 2 7 3 8 9 8 0 6 4 4 9X1X2＋0.026101666667X1X3＋0.012287865741X2X3，其相關(guān)系數(shù)R2＝0.8602，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj＝0.9639，F(xiàn)＝4.9135，P＝0.1089，方差分析結(jié)果表明，建立的回歸方程具有統(tǒng)計學意義。

DPS軟件同時生成最高指標時各因素的條件組合，即當酶解pH8、酶解溫度49℃、酶解時間48h時能夠得到最大的蛋白溶解指數(shù)，為65.4758%。蛋白溶解指數(shù)反應(yīng)的是花粉經(jīng)酶解后溶出的蛋白質(zhì)與不加酶時比較，所得到的增加量，也就是說在最佳酶解條件下，溶出的內(nèi)容物占花粉總內(nèi)容物的比例。

從本試驗可以看出，均勻設(shè)計適用于花粉破壁的研究，在考察影響花粉破壁的多因素多水平試驗中，與以往的正交試驗設(shè)計相比，均勻設(shè)計的試驗點分散均勻，且試驗次數(shù)減少，大大提高了試驗的效率和準確度。

2.2 酶解對蜂花粉比表面積的影響

將試驗得到的比表面積的數(shù)據(jù)添加至DPS軟件的數(shù)據(jù)欄中，如表2所示，利用DPS軟件進行二元逐步回歸方差分析，軟件將根據(jù)輸入的數(shù)據(jù)生成一個二元方程如下：

Y2＝－122.11058－18.280596953X1＋7.356035932X2＋0.6489000000X12－0.07625800000X22－0.006245024911X32＋0.12175741935X1X2＋0.03649629630X1X3＋0.003590231481X2X3，其相關(guān)系數(shù)R2＝0.9105，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj＝0.6107，F(xiàn)＝1.8176，P＝0.03379，方差分析結(jié)果表明，建立的回歸方程具有統(tǒng)計學意義。

比表面積是指1g固體物質(zhì)的總表面積，即物質(zhì)內(nèi)部的內(nèi)表面積和外部的外表面積之和[12]。比表面積值越大，說明在相同體積條件下同種物質(zhì)的總表面積越大，因此可以在一定程度上反應(yīng)花粉粒的破壁情況和內(nèi)容物的溶出情況，若蛋白酶實現(xiàn)了酶解作用，花粉壁上的蛋白物質(zhì)會被降解，這樣就會露出外壁的細微結(jié)構(gòu)，萌發(fā)孔也會打開并露出部分內(nèi)表面，同時內(nèi)容物溶出，比表面積則會變大。DPS軟件根據(jù)以上多元方程進行分析，結(jié)果表明獲得最大比表積時的酶解pH8、酶解溫度47℃、酶解時間48h，最大比表面積為12.6996m2/g。

2.3 最佳酶解條件的確定

比較蛋白溶解指數(shù)和比表面積的測定結(jié)果，兩者獲得最優(yōu)解時的條件非常接近。綜合兩者的數(shù)據(jù)，得到最佳的破壁條件為酶解pH8、酶解溫度48℃、酶解時間48h。

2.4 油菜蜂花粉在最佳酶解條件下的表征評定

2.4.1 比表面積

依照2.3節(jié)中獲得的最佳酶解條件處理花粉，并做空白對照，得到空白樣品的比表面積值為5.2013m2/g，經(jīng)酶解處理樣品的比表面積值為12.7688m2/g，油菜蜂花粉經(jīng)處理后比表面積增加了145.49%，可見比表面積明顯增加。說明在合適條件下經(jīng)酶處理后，花粉液中的小粒徑顆粒增多，一方面可能是因為花粉中的內(nèi)容物溶出，增加了小粒徑物質(zhì)的數(shù)量，另一方面可能是因為花粉壁上的蛋白質(zhì)被破壞，內(nèi)壁外露，花粉粒的表面積相對增加，因此說明酶解后花粉實現(xiàn)了破壁，并促進了內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的溶出。

2.4.2 粒度分析

圖1 蜂花粉的粒度分析Fig.1 Particle size distribution of rape bee pollen with and without protamex treatment

由圖1可見，空白和加酶樣品的粒度分布有明顯的不同，同時分析軟件給出的數(shù)據(jù)包括，空白樣品50%顆粒粒徑小于25.648μm，90%顆粒粒徑小于51.837μm，花粉粒的平均粒徑為31.138μm；加酶樣品中50%顆粒的粒徑小于23.039μm，90%顆粒粒徑小于31.329μm，花粉粒的平均粒徑為23.747μm。以上數(shù)據(jù)都說明加酶后樣品中許多花粉粒的粒徑明顯減小，總體分布上向小粒徑方向移動，該結(jié)果可能是由于經(jīng)酶處理的花粉表面覆蓋物被去除，細胞壁變薄，萌發(fā)孔打開所造成的，這樣也必然利于花粉內(nèi)容物的溶出。

利用激光粒度分析儀測定粒度，主要是從花粉壁破碎角度進行評定。與以往利用顯微鏡照片進行粒度分析的方法相比，采用此方法進行分析所得出的結(jié)果更加接近真實數(shù)據(jù)，且具有說明力，因為它所測定的對象是整個體系中的所有花粉粒，從而避免了因取樣量有限帶來的結(jié)果偏差。

2.4.3 Zeta電位

Zeta電位是反映懸浮物穩(wěn)定性的重要指標，Zeta電位絕對值越大，說明體系中顆粒間排斥勢壘越高，則粒子間越穩(wěn)定。當液體中顆粒少時，相互間的斥力可視為零，顆粒會不停的做布朗運動，增加碰撞的可能性，體系不穩(wěn)定；顆粒增多后，相互間會因距離減小而斥力增大，這就抵消了液體分子對其的部分作用力，體系變得穩(wěn)定。從圖2可知，空白樣品Zeta電位絕對值為11.89mV，而加酶樣品Zeta電位絕對值為24.49mV，酶解后的樣品電位比空白樣品高12.60mV，加酶樣品液更穩(wěn)定。這說明加酶蜂花粉細胞壁的通透性有所改善，內(nèi)容物從花粉內(nèi)部釋放到外界，因溶液中內(nèi)容物顆粒數(shù)量增多，且均勻分散，所以顆粒間距離會減小，又因為內(nèi)容物顆粒表面帶有相同的電荷，而產(chǎn)生高靜電排斥，所以體系穩(wěn)定。

圖2 蜂花粉的Zeta電位Fig.2 Zeta potential of rape bee pollen with and without protamex treatment

Zeta電位大小反應(yīng)了花粉內(nèi)容物的溶出情況，是從溶液穩(wěn)定性的角度進行表征評定。該方法從一個全新的視角用宏觀的電位值來反應(yīng)微觀世界發(fā)生的物質(zhì)變化，具有一定說明力。

2.4.4 掃描電鏡

成熟蜂花粉的花粉壁可以明顯地區(qū)分為兩層，即外壁和內(nèi)壁，外壁主要由孢粉素和纖維素構(gòu)成，內(nèi)壁主要由纖維素和果膠構(gòu)成，并且油菜蜂花粉的壁上等距離分布著3個萌發(fā)孔，萌發(fā)孔處只有內(nèi)壁而缺少外壁，它是花粉最易受環(huán)境影響的部位，因此要在此處破壞花粉壁的結(jié)構(gòu)以達到破壁的目的。在通常情況下，花粉粒的外表面有覆蓋物，它附著在花粉表面，當花粉釋放后起著保護花粉免受損傷和侵染的作用，從另一角度來說也就限制了萌發(fā)孔的打開和內(nèi)容物的溶出。從圖3酶解前后油菜蜂花粉的對比照片可見，空白樣品中的花粉?；境汕蛐?，萌發(fā)孔沒有顯露出來，并且花粉壁表面附著著大量的覆蓋物，阻礙了其內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的溶出釋放。而加酶處理后的花粉粒，其表面的覆蓋物已完全去除，可以清晰的觀察到花粉外壁光滑多孔的結(jié)構(gòu)，而且花粉粒的3個萌發(fā)孔都已經(jīng)打開并向外擴張，花粉?；境深惐馇蛐危ǚ鄣膬?nèi)容物則通過萌發(fā)孔處向外溶出。由此可以判定，酶解改善了蜂花粉細胞壁的通透性，并使其內(nèi)容物溶出。

圖3 蜂花粉的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM micrograph of rape bee pollen with and without protamex treatment

2.4.5 透射電鏡

從圖4空白樣品的超薄切片照片可清楚的看到蜂花粉內(nèi)部結(jié)構(gòu)，由外到內(nèi)依次是外壁、內(nèi)壁和內(nèi)容物，外壁又分為外壁外層和外壁內(nèi)層，外壁外層結(jié)構(gòu)的空隙內(nèi)充滿著覆蓋物，花粉壁上沒有外壁只有內(nèi)壁的部位稱為萌發(fā)孔，內(nèi)壁像一層彈性膜一樣包裹著內(nèi)容物?？瞻讟悠返幕ǚ郾诮Y(jié)構(gòu)完整，花粉粒中充滿了內(nèi)容物，沒有發(fā)生外溢。而經(jīng)過酶解的樣品，花粉的形態(tài)有了明顯改變，花粉外壁不再連續(xù)完整，3個萌發(fā)孔處的內(nèi)壁都有不同程度的外突，內(nèi)部物質(zhì)成團聚狀外溢，有些花粉粒的內(nèi)容物在此剖面上已完全溢出。因此，可以認為加酶處理能夠明顯改善花粉壁的通透性，且促使內(nèi)溶物溶出。

圖4 蜂花粉的透射電鏡照片F(xiàn)ig.4 TEM micrograph of rape bee pollen with and without protamex treatment

本實驗嘗試利用全新的檢測技術(shù)從不同角度對蜂花粉破壁、內(nèi)容物溶出情況進行表征評定。比表面積、激光粒度分析和Zeta電位測定是利用物理指標對酶解蜂花粉進行評定，電鏡的使用直觀呈現(xiàn)了花粉酶解前后的形態(tài)改變，照片比光鏡更清晰，也比單純的數(shù)據(jù)結(jié)果更有說力。各表征評定結(jié)果相互吻合，共同驗證了酶處理花粉，能夠使其細胞壁通透性改善、內(nèi)容物溶出這一假設(shè)。

3 結(jié) 論

3.1 利用復合蛋白酶酶解油菜蜂花粉得到的最佳酶解條件為pH8、溫度48℃、時間48h，表征結(jié)果說明蛋白酶作用花粉效果顯著，是一種理想的破壁方法。

3.2 在最佳酶解條件下測定的粒度結(jié)果顯示，酶解后花粉粒徑減小，總體在向小粒徑方向移動，這表明花粉的細胞壁完整性被破壞。

3.3 Zeta電位結(jié)果反應(yīng)了在最佳酶解條件下內(nèi)容物的變化，說明酶解后的花粉壁通透性改善，溶解在溶液中的內(nèi)容物明顯增加。

3.4 掃描電鏡和透射電鏡的表征結(jié)果印證了粒度分析和Zeta電位的結(jié)論，直觀的呈現(xiàn)了酶解前后花粉粒內(nèi)外的變化，外部花粉壁不再完整，萌發(fā)孔打開，內(nèi)部內(nèi)容物溶出，含量減少。

綜上所述，用復合蛋白酶酶解油菜蜂花粉，并首次應(yīng)用比表面積、激光粒度、Zeta電位、電鏡等新方法對其進行表征評定，揭示了花粉破壁的本質(zhì)，各表征評定指標都能驗證酶解促進花粉破壁、內(nèi)容物溶出這一結(jié)論，它們共同建立起了科學可靠的花粉破壁表征評定體系。

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Protamex Hydrolysis and Cell Wall of Rape Bee Pollen

GAO Kun，ZHANG Hong-cheng，DONG Jie*
(Institute of Agicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China)

Bee pollen is rich in nutrients, most of which are present inside the cells. The development and exploitation of bee pollen is restricted by the existing cell wall. An investigation to cell wall disruption of rape bee pollen by means of protamex hydrolysis was carried out in this study. The optimal cell wall disruption conditions were found to be: pH 8, 48 ℃ and 48 h hydrolysis. Rape bee pollen with protamex treatment under these conditions was observed under SEM (scan electron microscope)and TEM (transmission electron microscope), and the specific surface area, particle size and Zeta potential were characterized.The results obtained collectively indicate the role of protamex hydrolysis in improving the permeability of rape bee pollen cells from different perspectives.

bee pollen；protamex；cell wall disruption；cell permeability

S896

A

1002-6630(2011)20-0099-05

2011-01-05

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(nyhyzx07-041)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(200808)

高鯤(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為蜂產(chǎn)品化學。E-mail：gaokunkun2008@163.com

*通信作者：董捷(1966—)，女，研究員，碩士，研究方向為功能食品與生物活性物質(zhì)。E-mail：jiedon@126.com