高向陽，劉 娜

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

AccQ·Tag柱前衍生反相-高效液相色譜法測定齒果酸模中的氨基酸含量

高向陽，劉 娜

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為研究齒果酸模中氨基酸的種類和含量，探討其營養(yǎng)特性和食用開發(fā)價(jià)值。以6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)為衍生試劑，以磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相A，乙腈溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫；在柱溫37℃條件下用AccQ·Tag進(jìn)行柱前衍生，反相-高效液相色譜法用紫外檢測器在波長248nm進(jìn)行測定。結(jié)果表明：齒果酸模中含有17種氨基酸，干基總含量為252.35mg/g，有很好的食用開發(fā)前景。17種氨基酸線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r在0.9995以上(n＝5)，測定的平均回收率為97.1%～102.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.3%～3.2%(n＝3)，測定結(jié)果令人滿意。

齒果酸模；AccQ·Tag柱前衍生；反相-高效液相色譜法；氨基酸

齒果酸模(Rumex dentatua)，為蓼科酸模屬，一年或多年生草本，別名牛舌草、土大黃，牛舌棵子、野菠菜等。主要分布在尼泊爾、印度、阿富汗、哈薩克斯坦及歐洲東南部等國家和地區(qū)。我國華北、西北、華東、華中等地區(qū)齒果酸模自然資源也極為豐富[1]，但長期以來，該植物的營養(yǎng)特性和食用價(jià)值沒有受到人們的關(guān)注，未見進(jìn)行研究、開發(fā)和充分利用[2]。

氨基酸是生物體不可缺少的營養(yǎng)成分，對促進(jìn)人體生長發(fā)育具有重要作用，目前，主要采用茚三酮柱后衍生，用氨基酸自動(dòng)分析儀測定。AccQ·Tag法是一種用于肽及蛋白水解氨基酸分析的柱前衍生新技術(shù)，用AQC(6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基-氨基甲酸酯)為衍生劑，可與所有含氨基化合物快速定量反應(yīng)生成高穩(wěn)定性脲(最大吸收波長為248nm)，然后用反相高效液相色譜儀分離衍生產(chǎn)物，用熒光或紫外檢測器檢測[3]。柱前衍生反相高效液相色譜法(reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)因具有通用性強(qiáng)、選擇性好、分離度高、可分析多種物質(zhì)等顯著優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于樣品中氨基酸的測定[4-6]。

齒果酸模中蛋白質(zhì)和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的測定至今未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)用AccQ·Tag柱前衍生RP-HPLC分析技術(shù)，對鄭州地區(qū)齒果酸模中氨基酸的種類和含量進(jìn)行測定，為進(jìn)一步開發(fā)和利用齒果酸模食品自然新資源，提供科學(xué)依據(jù)和重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

齒果酸模(Rumex dentatua)全株采集于河南省鄭州市東風(fēng)渠旁，葉苗呈新鮮、潤亮淺綠色。

AccQ·Tag氨基酸測定試劑盒(包括AccQ·Flour氨基酸專利衍生劑、專用氨基酸分析柱、玻璃樣品衍生管)、17種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(濃度均為100μmol/mL)美國Waters公司；磷酸鹽緩沖溶液；濃鹽酸(AR)；氫氧化鈉(AR)；乙腈(色譜純)；實(shí)驗(yàn)用水的電阻率為18.3MΩ·cm，采用美國Millpore公司水處理設(shè)備制造。

515高效液相色譜儀(配有2487紫外檢測器、色譜工作站) 美國Waters公司；Fw-100型高速萬能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；VIC-412型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；101-2-S-Ⅱ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SK5200H 型超聲波洗滌器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；XK96-B型快速混勻器 姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱(3.9mm ×150mm，4μm)；流速：1.0mL/min；柱溫：37℃；紫外檢測波長：248nm；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相A為Waters公司提供的儲(chǔ)備液，按1:10(V/V)用水稀釋；流動(dòng)相B為乙腈-水60:40(V/V)；梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的制備

用移液器移取100μL有17種氨基酸的標(biāo)樣，加0.90mL水稀釋，混勻，備用。該標(biāo)準(zhǔn)溶液的氨基酸濃度為10μmol/mL。精確吸取10μL于衍生用小管中(6× 50mm)，加入70μL硼酸鹽緩沖液，渦旋混合后，在渦旋狀態(tài)下加入20μL剛配好的AccQ·Fluor衍生劑，保持渦旋混合15s。室溫放置lmin后用石蠟?zāi)し饪?，?0℃烘箱內(nèi)加熱10min，取出冷至室溫，供在1.2節(jié)色譜條件下進(jìn)行氨基酸分析[7-8]。

1.4 試液的制備和測定

將新采集的齒果酸模樣品洗凈風(fēng)干，在55℃恒溫干燥箱中干燥至質(zhì)量恒定，粉碎后過60目篩。準(zhǔn)確稱取齒果酸模干樣粉末0.1000g置于水解管中，加入6mol/L鹽酸10mL，封口，置110℃鼓風(fēng)干燥箱中水解24h。放冷調(diào)pH8～10，用水定容至50.00mL，混勻、過濾，再經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，備用[9-11]。

精確吸取濾液10μL于衍生小管中(6×50mm)，加10μL緩沖液，邊渦旋邊加入20μL衍生試劑后，移至自動(dòng)進(jìn)樣微量小瓶中，密閉，置于55℃烘箱中10min，取出冷至室溫，供在1.2節(jié)色譜條件下進(jìn)行氨基酸分析[12-13]。按下式計(jì)算測定結(jié)果：

式中：ρB為干基樣品中被測氨基酸組分的含量/ (mg/g)；CB為試液中被測氨基酸組分測得的濃度/(μmol/ mL)；m為稱樣量/g；M被測氨基酸組分的摩爾質(zhì)量/ (g/mol)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解條件的選擇

準(zhǔn)確稱取0.1000g粉末樣品置于水解管中，分別加入10mL 4mol/L、6mol/L和8mol/L鹽酸，封口，110℃恒溫水解18、24h和30h，放冷，調(diào)pH8～10，定容至25mL，混勻、過濾，再經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后作為試液，在上述液相色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果表明：110℃用6mol/L鹽酸恒溫水解24h為最佳水解條件。

2.2 工作曲線

將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液配制成濃度為2.5、5.0、10、15、20μmol/mL的系列溶液，各取10μL按1.4節(jié)方法衍生后進(jìn)行5次平行測定，以濃度C/(μmol/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積A/(μV·s)為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，利用峰面積與濃度進(jìn)行線性回歸[14]，按3倍信噪比(RSN=3)計(jì)算檢出限，結(jié)果如表2所示。

表2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(n=5)Table 2 Standard curves and detection limits of 17 amino acids (n = 5)

表2結(jié)果表明，在工作曲線濃度范圍內(nèi)，峰面積與氨基酸濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.9995以上。

2.3 試液的穩(wěn)定性

用 AQC(6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基-氨基甲酸酯)為衍生劑，與含氨基化合物快速定量反應(yīng)生成高穩(wěn)定性脲衍生物，最大吸收波長為248nm，衍生試液在室溫下可穩(wěn)定一周，24h內(nèi)完成測定，結(jié)果良好[15-16]。

2.4 回收率和精密度

精確稱取齒果酸模粉末0.0250g置于水解管中，加入10μmol/mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液后，按1.4節(jié)方法進(jìn)行加標(biāo)回收率平行測定(n＝3)，結(jié)果如表3所示。

表3 17種氨基酸的加標(biāo)回收率(n=3)Table 3 Spike recoveries of 17 amino acids (n = 3)

由表3可知，加標(biāo)回收率在97.1%～102.6%，RSD小于3.3%。

2.5 測定結(jié)果

在1.2節(jié)色譜條件下，取標(biāo)準(zhǔn)混合液和樣品溶液各10μL進(jìn)樣分析，測定峰面積值，同時(shí)對樣品進(jìn)行3次平行測定。標(biāo)準(zhǔn)混合液氨基酸分析色譜圖見圖1A，樣品分析色譜圖見圖1B，測定結(jié)果見表4。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品(B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of amino acid standards and sample from Rumex dentatus

表4 齒果酸模氨基酸分析結(jié)果(n=3)Table 4 Retention times and contents of 17 amino acids in Rumex dentatus (n = 3)

由圖1B和表4可知，齒果酸模干基樣品中含有17種氨基酸，氨基酸總量為252.35mg/g，其中人和其他哺乳動(dòng)物需要的7種必需氨基酸(苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、纈氨酸、精氨酸、組氨酸、蘇氨酸)含量為72.54mg/g，占總氨基酸含量的28.75%。同時(shí)，依據(jù)必需氨基酸指數(shù)計(jì)算公式：EAAI－[(Thrp÷ThrS)×(Tyrp÷TyrS)×(Valp÷ValS)×(Metp÷MetS)×(Lysp÷LysS)× (Ilep÷IleS)×(Leup÷LeuS)×(Phep÷PheS)]×100%得知，齒果酸模中各種氨基酸含量分布合理，非常適宜人體吸收利用[17-19]。

3 結(jié) 論

氨基酸在人體中具有重要的生理功能，尤其是必需氨基酸，人體缺乏一種或幾種必需氨基酸，就不能維持正常的生長發(fā)育。研究表明：齒果酸模中含有17種氨基酸，其中，人體所需的必需氨基酸有7種，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的28.75%。在所含氨基酸中，天門冬氨酸含量高達(dá)26.46mg/g，占氨基酸總含量的10.49%，對治療心血管病及泌尿系統(tǒng)疾病有很大的作用。因此，食用齒果酸?？裳a(bǔ)充人體新陳代謝和肌體生長發(fā)育需要的氨基酸，特別是必需氨基酸，能夠平衡膳食中氨基酸的不足并具有增強(qiáng)肌體的免疫調(diào)節(jié)能力，利于人體健康。本研究對于進(jìn)一步開發(fā)齒果酸模新型食品資源，具有一定的積極意義和指導(dǎo)作用。

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Determination of Amino Acid Contents in the Whole Plant ofRumex dentatusby Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography with AccQ·Tag Pre-column Derivatization Method

GAO Xiang-yang，LIU Na
(College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Objective: To determine the composition and contents of amino acids in the whole plant ofRumex dentatusfor further study of its nutritional characteristics and food value. Methods: Amino acids were derivatized by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate (AQC), and then their derivatives were separated on a Waters 515 HPLC system with a column temperature of 37 ℃ using phosphate buffer as mobile phase A and aqueous acetonitrile as mobile phase B in the gradient elution mode and detected at 248 nm using a UV detector. Results: Totally 17 amino acids were found, and the total content of amino acids in samples was 252.35 mg/g. The correlation coefficients of the calibration curves for 17 amino acids were all above 0.9995 (n= 5). The average spike recoveries of 17 amino acids were between 97.1% and 102.6% with a relative standard deviation (RSD) between 0.3% and 3.26% (n= 3).

Rumex dentatus；AccQ·Tag pre-column derivatization；reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC)；amino acids

TS201.4

A

1002-6630(2011)20-0160-04

2010-12-18

河南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(10466-X-082301)

高向陽(1949—)，男，教授，大學(xué)，主要從事食品分析、食品新資源開發(fā)研究。E-mail：ndgaoxy@163.com