徐桂敏，楊瑞金*，張文斌，趙 偉，華 霄，蔣孝燕

(1.江南大學 食品科學與工程國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

一種連續(xù)分離純化酪蛋白磷酸肽的新工藝

徐桂敏1，楊瑞金2,*，張文斌2，趙 偉2，華 霄2，蔣孝燕1

(1.江南大學 食品科學與工程國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

為建立一條制備酪蛋白磷酸肽(CPPs)的新工藝路線。采用酶解與超濾耦聯(lián)技術初步分離制備酪蛋白生物活性肽，然后通過樹脂層析將酪蛋白生物活性肽中的酪蛋白磷酸肽和非磷酸肽分離。選用堿性蛋白酶Alcalase在切向流酶膜反應器中(膜截留分子質(zhì)量10kD)連續(xù)酶解3h、酶解溫度50℃、pH8.5。重點研究大孔弱堿性陰離子交換樹脂D303對酪蛋白生物活性肽的分離純化工藝，并采用單因素試驗優(yōu)化CPPs的分離純化工藝參數(shù)，確定D303樹脂的較佳動態(tài)吸附解吸條件：上樣流速1BV/h、上樣量100mL、洗脫溫度45℃、洗脫酸濃度0.15mol/L HCl，獲得磷酸肽N/P比為7.21，P洗脫得率為93.11%。

酶膜反應器；層析分離；酪蛋白磷酸肽；N/P；純化

酪蛋白中富含多種生物活性肽，如酪蛋白磷酸肽、抗氧化活性肽、免疫活性肽和血管緊張素轉化酶抑制劑等多種功能肽，其中磷酸肽(casein phosphopeptides，CPPs)的研究和開發(fā)是相對最早的。大量研究表明，酪蛋白經(jīng)胃腸消化后，產(chǎn)生酪蛋白磷酸肽，具有很強的礦物質(zhì)結合能力[1]。同時，酪蛋白磷酸肽在人體營養(yǎng)系統(tǒng)中起著極其重要的作用[2]，如促進兒童骨骼和牙齒的發(fā)育，促進骨折患者的康復，預防和改善缺鐵性貧血，抗齲齒[3]等，是一類極具開發(fā)價值的功能性食品添加劑。

國內(nèi)外研究者[4-9]已采用不同方法制備了CPPs，取得了較好效果，但也存在能耗大、純度低、生產(chǎn)工藝復雜、無法解決底物及酶的浪費等問題，工業(yè)化生產(chǎn)難度大。因此，建立一條連續(xù)分離制備低N/P比和CPPs高得率的新工藝路線，且操作簡單、工藝成本低、易于自動化及工業(yè)化的方法是非常有意義的。

酪蛋白磷酸肽在日本、東南亞、歐洲、澳大利亞等地已被廣泛應用于食品行業(yè)，在我國除了廣州輕工業(yè)研究所有少量的磷酸肽CPPs作為鈣吸收劑上市，尚未見有工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)磷酸肽CPPs的報道。酶膜反應器(enzymatic membrane reactor，EMR)的應用可以實現(xiàn)小分子量水解產(chǎn)物從酶解產(chǎn)物中連續(xù)分離[10]，截留大分子底物及酶，減少底物抑制作用，減少游離氨基酸含量[11]，并且能夠降低酶損耗、提高蛋白轉化率、降低生產(chǎn)成本。然后，采用樹脂層析分離純化酪蛋白磷酸肽，工藝操作簡單，成本低，易于大規(guī)?；a(chǎn)。因此選擇正確的樹脂層析分離工藝，并優(yōu)化最佳的層析分離工藝參數(shù)，可以實現(xiàn)低N/P比和高得率CPPs產(chǎn)品的連續(xù)分離制備。本研究擬建立以酶膜反應器和樹脂層析耦聯(lián)連續(xù)分離純化酪蛋白磷酸肽的新型工藝，旨在解決酪蛋白磷酸肽工業(yè)化生產(chǎn)難度大，成本高等問題。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

酪蛋白(食品級) 甘肅華羚有限公司；Alcalase FG 2.4L(酶活力2×105U/g) 美國Sigma公司；大孔弱堿性陰離子交換樹脂D303 上海華震科技有限公司；其他試劑均為分析純或優(yōu)級純。

Pellicon超濾系統(tǒng)和超濾膜(截留分子質(zhì)量10kD) 美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 連續(xù)酶解分離純化酪蛋白磷酸肽工藝及流程圖

工藝及流程圖見圖1。

圖1 連續(xù)分離制備酪蛋白磷酸肽的工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram of continuous preparation of casein phosphopeptides

酪蛋白生物活性肽的制備[12-13]：分別配制質(zhì)量分數(shù)10%和6%的酪蛋白溶液，通過酶膜反應器連續(xù)酶解制備酪蛋白生物活性肽。操作工藝參數(shù)：E/S=0.05mL/g、酶解溫度50℃、pH8.0～8.5、超濾設備進口壓力10psi、出口壓力6psi。將400mL 10%酪蛋白溶液加入酶反應器中，開啟恒溫水浴并升溫至50℃，在攪拌狀態(tài)下加入Alcalase開始連續(xù)酶解反應并計時，酶解過程采用pH-stat法維持酶解液pH值恒定，酶解10min后，開啟超濾裝置。超濾過程中，大分子底物及酶被膜截留返回到酶反應器內(nèi)繼續(xù)循環(huán)降解，而小于超濾膜平均截留分子質(zhì)量的多肽透過膜組件形成滲透液(酪蛋白生物活性肽溶液)，當有滲透液形成時，開啟進料泵(料液為pH8.5，6%酪蛋白溶液)，進料速度同滲透速度，以維持反應液體積和蛋白含量近似恒定。

酪蛋白磷酸肽的分離純化：上述酪蛋白生物活性肽溶液以一定流速流經(jīng)D303大孔弱堿性陰離子交換樹脂進行分離純化，通過水洗獲得非磷酸肽，再經(jīng)洗脫劑洗脫得到酪蛋白磷酸肽。

1.2.2 樹脂預處理

樹脂Cl型處理：樹脂D303用清水浸泡充分溶脹后，用質(zhì)量分數(shù)5% HCl溶液浸泡4h，去離子水沖洗至中性，用質(zhì)量分數(shù)5% NaOH溶液浸泡4h，去離子水沖洗至pH8.0左右，再用5% HCl溶液浸泡4h，去離子水沖洗至pH4.0左右，裝柱，柱規(guī)格Φ2.6cm×50cm，床體積200mL。

樹脂OH型處理：處理順序為清水溶脹、NaOH溶液浸泡、去離子水沖洗、HCl溶液浸泡、去離子水沖洗、NaOH溶液浸泡、去離子水沖洗至pH8.0左右，具體操作方法同上。

1.2.3 靜態(tài)吸附與解析實驗

取處理好的樹脂50mL置于250mL燒杯中，加入酪蛋白生物活性肽溶液25mL，進行靜態(tài)吸附實驗。開啟磁力攪拌(速度為1檔)，每隔5min吸取吸附液0.1mL，稀釋到5mL于220nm波長處測OD值，直到OD值穩(wěn)定認為吸附實驗終止。解析實驗操作步驟同吸附實驗，最后分別測定吸附液及解析液的含N質(zhì)量分數(shù)、含P質(zhì)量分數(shù)。

1.2.3.1 洗脫劑的確定

樹脂轉型為Cl型時進行蛋白質(zhì)吸附實驗，攪拌吸附90min后，分別選用0.2mol/L NaOH溶液和0.2mol/L HCl溶液作為洗脫劑，進行靜態(tài)酸、堿洗脫實驗，確定最佳洗脫劑。

1.2.3.2 樹脂轉型處理對分離純化CPPs的影響

對于樹脂的轉型，本實驗分別考察樹脂轉型為Cl型、OH型時，對酪蛋白生物活性肽的吸附及解析效果，探討其對CPPs分離純化的影響。

1.2.4 動態(tài)洗脫分離純化CPPs工藝條件的優(yōu)化

1.2.4.1 上樣量對CPPs分離純化效果的影響

樹脂轉型為Cl型時進行動態(tài)洗脫實驗。分別取膜滲透液75、100、125、150mL(蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)5%)上樣至大孔弱堿性陰離子交換樹脂，考察上樣量對CPPs分離效果的影響。其他工藝條件：上樣流速及洗脫流速1.5BV，洗脫溫度25℃，洗脫酸濃度0.2mol/L HCl。

1.2.4.2 上樣流速對CPPs分離純化效果的影響

用選定的上樣量進行，洗脫流速1.5BV。調(diào)整上樣流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0BV/h，從獲得CPPs的N/P比及P得率判斷最佳上樣流速。

1.2.4.3 洗脫溫度對CPPs分離純化效果的影響

用選定的上樣量及上樣流速進行。調(diào)整循環(huán)水浴溫度分別為25、30、35、40、45、50℃，考察溫度對分離純化CPPs的影響。

1.2.4.4 洗脫酸濃度對CPPs分離純化效果的影響

用選定的上樣流速、上樣量、洗脫溫度進行。洗脫酸(HCl)濃度分別為0.1、0.15、0.2、0.25mol/L洗脫CPPs，考察酸濃度對分離純化的影響。

1.3 分析及檢測方法

洗脫液中蛋白質(zhì)質(zhì)量測定：雙縮脲法[14]；洗脫液中N質(zhì)量分數(shù)計算：蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)/6.38；洗脫液中磷質(zhì)量分數(shù)測定：Morrision微量快速定磷法[15]；N/P比=N的質(zhì)量分數(shù)×31/(P的質(zhì)量分數(shù)×14)；P得率/%=洗脫液中P總質(zhì)量/上樣液中P總質(zhì)量×100

2 結果與分析

2.1 酪蛋白及酪蛋白活性肽成分分析

表1 酪蛋白及酪蛋白活性肽成分分析Table 1 Composition of casein and casein peptides

經(jīng)酶解-超濾過程，可制備完全澄清的酪蛋白活性肽溶液。由表1可知，酪蛋白活性肽溶液的N/P比相對原料而言降低為33.47，這說明超濾過程中有相對較多的非磷酸肽以大分子片段存在，不能及時透過超濾膜，而含P多肽透過量相對較多，所以酪蛋白活性肽溶液中CPPs含量相對變高，有利于后期CPPs的分離純化。

2.2 靜態(tài)法確定樹脂分離純化工藝

2.2.1 洗脫劑的確定

為避免產(chǎn)品引入過多的雜質(zhì)，本實驗選用HCl溶液和NaOH溶液作為樹脂分離純化的洗脫劑。當采用0.2mol/L NaOH溶液洗脫時，洗脫后的CPPs的N/P比為121.46，與原料相比，N/P比偏高，洗脫效果較差，結果見圖2。這可能是由于在堿性范圍內(nèi)，大多數(shù)多肽處于電負性，與樹脂間的靜電相互作用增強，這樣就使得CPPs更難以洗脫下來。導致CPPs的N/P比值變大。而采用0.2mol/L HCl溶液洗脫，CPPs的N/P比為12.75，考慮到優(yōu)先吸附順序Cl－＞PO43+以及環(huán)境pH值影響，低濃度酸洗脫效果更好。

圖2 洗脫劑對分離純化CPPs的影響Fig.2 Effect of eluents on separation and purification of CPPs

2.2.2 樹脂轉型處理對分離純化CPPs的影響

圖3 Cl型、OH型上樣對CPPs分離純化的影響Fig.3 Effect of different anion types of resin D303 on separation and purification of CPPs

圖4 Cl型、OH型上樣過程蛋白質(zhì)含量隨時間的變化曲線Fig.4 Change of protein content during sample loading onto different anion types of resin D303

圖3 表明，樹脂轉型為Cl型時，獲得CPPs的N/P比為12.81，低于樹脂轉型為OH型時CPPs的N/P比。這主要受pH值變化影響，結合圖4可知，OH型上樣對蛋白質(zhì)的吸附量很高，同樣解吸下來的蛋白質(zhì)也多，隨著吸附實驗的進行，OH型樹脂中OH－不斷被取代下來，溶液環(huán)境pH值變大，逐漸趨于堿性環(huán)境，導致溶液中大部分多肽帶負電，使離子交換平衡發(fā)生變化，最終導致大量的非磷酸肽(CNPPs)也競爭吸附到樹脂上，影響了CPPs與CNPPs的分離。而Cl型上樣保證了溶液的pH值在酸性范圍，使大部分CNPPs帶正電，不被樹脂吸附，從而更好地將二者分離，所以Cl型上樣分離純化效果優(yōu)于OH型上樣。

2.3 優(yōu)化樹脂分離純化CPPs的工藝參數(shù)

2.3.1 D303樹脂動態(tài)吸附解吸流出曲線

圖5 動態(tài)洗脫過程蛋白質(zhì)濃度隨時間變化曲線Fig.5 Change of protein concentration with time during dynamic elution

圖5 為D303樹脂分離純化CPPs過程圖，洗脫劑為0.2mol/L HCl，酪蛋白活性肽溶液流經(jīng)樹脂過程中，基于荷電性，帶負電的水解肽易于吸附到D303樹脂上，由于CPPs帶有PO43+，具有很強的電負性，易于競爭吸附到樹脂上，從而將CPPs與CNPPs分離。因此未被吸附到樹脂上的CNPPs采用水洗脫下來，洗脫液經(jīng)220nm波長檢測，形成圖5中第一個水洗峰。吸附到樹脂上的CPPs采用被樹脂優(yōu)先吸附的Cl－洗脫下來，經(jīng)紫外檢測形成圖上第二個酸洗峰。

2.3.2 上樣量對分離純化CPPs的影響

圖6 上樣量對分離純化CPPs的影響Fig.6 Effect of loading quantity on separation and purification of CPPs

圖6 表明，隨著上樣量的增大，CPPs的N/P比逐步降低，純度提高，但P的得率也相應降低。當上樣量過低時，CPPs的N/P比有明顯上升趨勢，可能是由于更多的CNPPs也競爭吸附到樹脂上，造成分離效果變差；上樣量過高，P的得率又明顯降低，這可能由于部分CPPs未被樹脂吸附而伴隨著CNPPs流出，導致CPPs損失，從而降低產(chǎn)品得率。因此僅當上樣量為100mL(蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)約5%，即上樣量約25mg/mL濕樹脂)，獲得CPPs的純度及得率比較適宜。

2.3.3 上樣流速對分離純化CPPs的影響

圖7 上樣流速對分離純化CPPs的影響Fig.7 Effect of loading flow rate on separation and purification of CPPs

隨著上樣流速的增大，CPPs的N/P比先降低后增大，當流速為1BV/h時，CPPs的純度及P得率最佳，增大或降低流速，都會影響分離效果，結果見圖7。這可能是由于流速過慢，影響樹脂的處理能力；流速過大，樹脂對多肽分子的吸附量下降，吸附性能降低，導致分離效果及得率不佳[16]。

2.3.4 洗脫溫度對分離純化CPPs的影響

圖8 洗脫溫度對分離純化CPPs的影響Fig.8 Effect of elution temperature on separation and purification of CPPs

從圖8可以看出，溫度對CPPs分離純化的影響較明顯，溫度為40～45℃時，制備的CPPs的純度較高。溫度增高，樹脂功能基團活性增強，多肽水解液黏度下降，多肽分子擴散速度加快，有利于促進多肽的吸附，從而制備高純度的CPPs，但是溫度過高CPPs的純度又有所降低，可能是由于弱堿性樹脂交換吸附酸根離子，發(fā)生酸堿中和反應，此反應為放熱反應，溫度過高不利于此反應的進行[17]。另外考慮到現(xiàn)實生產(chǎn)因素，高溫將產(chǎn)生巨大的能耗，因此確定最佳洗脫溫度為45℃。

2.3.5 洗脫酸濃度對分離純化CPPs的影響

隨酸濃度增大，P得率先增高后降低，結果見圖8。這說明CPPs的解吸能力先增大后降低，這種吸附與解析平衡取決于CPPs與離子交換樹脂間的靜電相互作用力強弱[18]。當HCl濃度為0.15mol/L時，P的洗脫得率最高，所得CPPs的N/P比最低，這說明此時CPPs與離子交換樹脂間的靜電相互作用力較弱，因而得到較好的洗脫效果，同時低濃度HCl洗脫也降低了后續(xù)除酸工作的難度。

圖9 洗脫酸濃度對分離純化CPPs的影響Fig.9 Effect of HCl concentration on separation and purification of CPPs

3 結 論

本實驗建立了一條新型連續(xù)分離純化CPPs的工藝路線。采用酶解與超濾耦聯(lián)初步分離酪蛋白磷酸肽，獲得N/P比為33.47的完全澄清的酪蛋白活性肽溶液；繼而采用大孔弱堿性陰離子交換樹脂D303分離純化CPPs，當上樣流速1BV/h、上樣量100mL、洗脫溫度45℃、洗脫酸濃度0.15mol/L HCl時，獲得酪蛋白磷酸肽的N/P比為7.21，P得率為93.11%。本法生產(chǎn)CPPs鹽含量較高，后期研究將采用納濾工藝脫除鹽分及游離氨基酸，進一步提高CPPs的純度。另外本法生產(chǎn)工藝簡單，可自動化操作，易于放大，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

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A Novel Process of Continuous Separation and Purification of Casein Phosphopeptides

XU Gui-min1，YANG Rui-jin2,*，ZHANG Wen-bin2，ZHAO Wei2，HUA Xiao2，JIANG Xiao-yan1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

A novel continuous preparation process of casein phosphopeptides (CPPs) was developed using enzymatic membrane reactor and anion-exchange chromatography. Alcalase was used to continuously hydrolyze 10% casein at pH 8.5 and 50 ℃ for 3 h in a tangential flow filter (TFF) enzymatic membrane reactor (EMR). The separation and purification of the resulting CPPs using anion-exchange resin D303 was investigated and the technological parameters were optimized by single factor design based on the recovery rate of phosphate and the molar ratio of nitrogen to phosphate. The results showed that the appropriate adorption/desorption conditions of D303 were as follows: loading permeate flow rate of 1 BV/h, sample loading quantity of 100 mL, elution temperature of 45 ℃, and hydrochloric acid concentration for elution of 0.15 mol/L, and the recovery rate of phosphate from the permeate was 93.11% and the molar ratio of nitrogen to phosphate was 7.21 under these conditions.

enzymatic membrane reactor；chromatography isolation；casein phosphopeptides；N/P molar ratio；purification

TS201.2

A

1002-6630(2011)08-0024-05

2010-05-20

國家“863”計劃項目(2008AA10Z313)

徐桂敏(1986—)，女，碩士研究生，主要從事食品生物工程技術研究。E-mail：xgm20091102@yahoo.cn

*通信作者：楊瑞金(1964—)，男，教授，博士，主要從事食品生物工程技術研究。E-mail：yrj@jiangnan.edu.cn