汪 泱， 張立行， 王共先， 謝 安， 婁遠蕾， 阮瓊芳， 崔蘇萍， 楊 陽

(南昌大學(xué)泌尿外科研究所, 江西 南昌 330006)

后腎細胞微環(huán)境誘導(dǎo)胚胎干細胞向腎系細胞分化的實驗研究*

汪 泱△， 張立行， 王共先， 謝 安， 婁遠蕾， 阮瓊芳， 崔蘇萍， 楊 陽

(南昌大學(xué)泌尿外科研究所, 江西 南昌 330006)

目的探討胚胎后腎細胞微環(huán)境誘導(dǎo)胚胎干細胞(ESCs)分化為腎系細胞的作用。方法小鼠D3系胚胎干細胞通過懸滴法制備擬胚體(EBs)，將EBs細胞與取自孕12.5 d小鼠胚胎的后腎細胞通過間接共培養(yǎng)以誘導(dǎo)其分化，即為共培養(yǎng)誘導(dǎo)組，設(shè)EBs細胞自然分化為對照組；采用免疫熒光染色法檢測共培養(yǎng)第3、5、7 d后的EBs細胞Pax2、WT-1蛋白表達情況，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測誘導(dǎo)3 d后的EBs細胞Pax2、WT-1、Lim1、Sall1、Emx2、GDNF、Wnt4、BMP7、Nephl、Nephrin、KSP和CD24 mRNA的表達情況。結(jié)果EBs細胞在誘導(dǎo)的第3 d即出現(xiàn)了全部腎發(fā)育相關(guān)基因的表達，其中共培養(yǎng)組Pax2、WT-1、Emx2、GDNF、Nephl、Nephrin、KSP和CD24的表達強于對照組；免疫熒光結(jié)果顯示在誘導(dǎo)3 d后的EBs細胞中可觀察到Pax2陽性細胞，陽性細胞數(shù)在共培養(yǎng)第5、7 d增多；誘導(dǎo)5 d后可觀察到WT-1陽性細胞，對照組未見Pax2或WT-1蛋白陽性細胞出現(xiàn)。結(jié)論后腎細胞微環(huán)境可促進ESCs分化為腎系細胞。

胚胎干細胞； 后腎細胞； 腎系細胞

急性腎衰竭的主要病因是各種原因?qū)е碌募毙阅I小管損傷，其轉(zhuǎn)歸依賴于腎內(nèi)存留的正常腎細胞數(shù)或具有修復(fù)作用的成體腎干細胞數(shù)目。目前，研究者致力研究修復(fù)損傷腎臟的方向之一是利用干細胞補充受損的腎細胞，其可能細胞來源包括胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)和自體的各種成體干細胞。成體干細胞的多向分化能力有限，而ESCs可分化為成體器官內(nèi)不同胚層的所有細胞，顯示出其獨特的優(yōu)勢。腎臟是由多種細胞組成的復(fù)雜器官，研究ESCs向腎臟細胞定向分化可為腎損傷的修復(fù)再生提供種子細胞的新來源。本研究擬將小鼠ESCs形成的擬胚體(embryoid bodies, EBs)細胞與分離自E12.5 d胎鼠的后腎細胞間接接觸共培養(yǎng)，體外模擬胚胎腎臟發(fā)育微環(huán)境，觀察ESCs向腎臟細胞定向分化狀況，為進一步建立ESCs向腎臟細胞定向分化的技術(shù)及研究ESCs分化為腎細胞的分子機制提供實驗基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1細胞株 小鼠D3胚胎干細胞株(ES-D3)購自中科院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所，小鼠后腎細胞和小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)均提取自昆明小鼠孕12.5 d(E12.5 d，觀察到陰道栓計孕0.5 d)胎鼠。昆明小鼠購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物科學(xué)部。

1.2主要試劑和儀器 H-DMEM、0.05% EDTA/胰蛋白酶、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺均購自Gibco。胎牛血清購自Hyclone。2-巰基乙醇購自Merk。絲裂霉素C購自Roche。兔抗小鼠WT-1抗體購自Neomarkers。兔抗小鼠Pax2抗體購自Abcam。羅丹明標記的?？雇肐gG購自Chemicon。倒置相差熒光顯微鏡(IX71)和體視顯微鏡均為Olympus產(chǎn)品。

2方法

2.1ES-D3細胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)EBs形成 將ES-D3細胞單細胞懸液添加到預(yù)先用絲裂霉素C處理過的MEF飼養(yǎng)層細胞上，ESCs培養(yǎng)液包含H-DMEM、20% 胎牛血清、0.1 mmol/L 2-巰基乙醇、0.1 mmol/L 非必需氨基酸和2 mmol/L L-谷氨酰胺，細胞放于37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵箱(Thermo)培養(yǎng)。制備EBs時，將脫離MEF飼養(yǎng)層細胞的ES-D3細胞制備為單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為約800-1 000 cells/30 μL，通過懸滴法培養(yǎng)制作EBs，在懸滴法培養(yǎng)的第3 d觀察并收集EBs，所用培養(yǎng)液為ESCs培養(yǎng)液。

2.2小鼠胚胎腎細胞的制備 取E12.5 d的孕鼠，無菌條件下打開腹腔，取出胎鼠，在體視顯微鏡下分離后腎。后腎提取方法參照文獻[2]。即取E 12.5d胎鼠放置在30 mm塑料培養(yǎng)皿中，用無菌眼科鑷子打開胎鼠腹腔，體視顯微鏡下在胎鼠神經(jīng)管兩側(cè)胎鼠后肢芽水平面附近找到小鼠后腎，取出胎鼠后腎置入培養(yǎng)皿中。將取出的后腎組織用生理鹽水清洗2遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊后以0.05% EDTA/胰蛋白酶消化，調(diào)節(jié)細胞密度為1×108cells/L，種植到12孔Transwells(Costar)的插入式小皿中，細胞培養(yǎng)液為ESCs培養(yǎng)液。

2.3EBs細胞與胚胎后腎細胞間接接觸共培養(yǎng) 將懸滴法制備的EBs加入12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入的EBs為10-20個。共培養(yǎng)組：采用Transwells進行間接接觸共培養(yǎng)，即將后腎細胞接種培養(yǎng)于Transwells的插入小皿中，EBs細胞培養(yǎng)于12孔板的小孔中，2種細胞進行間接接觸共培養(yǎng)，細胞分泌的因子可通過插入小皿的半透膜相互交換，但細胞間沒有直接接觸；自然分化對照組：于12孔細胞培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)EBs細胞。每天半量換液，共培養(yǎng)3 d后，每天全量換液，培養(yǎng)液為ESCs培養(yǎng)液。

2.4RT-PCR法檢測EBs細胞腎臟發(fā)育相關(guān)基因的表達 在共培養(yǎng)第3 d，按Trizol試劑盒說明(Invitrogen)分別提取共培養(yǎng)組、對照組和E 12.5 d后腎組織的總RNA。按照RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit說明書(Fermentas)兩步法逆轉(zhuǎn)錄總RNA。PCR反應(yīng)引物均由上海生物工程公司合成，引物序列及退火溫度見表1。PCR反應(yīng)參數(shù)分別是：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，58-67 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，32個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。

表1 引物序列和退火條件

2.5間接免疫熒光染色法檢測Pax2、WT-1蛋白的表達 在共培養(yǎng)第3、5、7 d按照間接免疫熒光法，分別檢測共培養(yǎng)組和對照組EBs細胞Pax2、WT-1蛋白表達情況，即將EBs細胞用PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定20 min，加入1%牛血清白蛋白(Roche)封閉20 min，再分別滴加兔抗小鼠Pax2、WT-1抗體，4 ℃飽和濕度孵育過夜，PBS充分洗滌后滴加羅丹明標記的牛抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，清洗后加入50 mg/L 4, 6-二乙酰基- 2-苯基吲哚(DAPI, Sigma) 襯染5 min。PBS洗滌后，熒光顯微鏡下觀察并記錄拍照。

結(jié) 果

1細胞形態(tài)變化

生長在MEF飼養(yǎng)層細胞上的ES-D3細胞形成相互分離的圓形或橢圓形細胞集落，細胞集落邊緣清楚,見圖1A。ES-D3細胞通過懸滴法制備的EBs呈圓球狀懸浮于ESCs培養(yǎng)液中，細胞透亮活性較好，見圖1B。單獨分離培養(yǎng)的后腎細胞大多呈現(xiàn)成體腎小管細胞樣的鋪路石樣細胞集落，見圖1C。EBs細胞在共培養(yǎng)的第1 d即貼壁，第2 d即可觀察到EBs周圍有少量細胞爬出，隨著培養(yǎng)天數(shù)延長爬出細胞逐漸增多，細胞形態(tài)表現(xiàn)為梭形、多角形、圓形或不規(guī)則形等，見圖1D。

Figure 1. Morphology of mouse embryonic stem cells on MEF feeder cells(A), embryoid body(B), primary culture of mouse E12.5 d metanephric cells(C) and EBs cells co-cultured with metanephric cells for 3 d(D).Bar=100 μm.

圖1小鼠胚胎干細胞、擬胚體、原代培養(yǎng)的胎腎細胞和3d共培養(yǎng)后的擬胚體細胞形態(tài)學(xué)觀察

2后腎細胞微環(huán)境可促進EBs細胞表達腎臟發(fā)育相關(guān)基因

與E12.5 d后腎細胞共培養(yǎng)3 d后的EBs細胞，均表達所檢測的12種腎臟發(fā)育相關(guān)基因，其中WT-1、Emx2、GDNF、Nephl、KSP和CD24 mRNA的表達明顯強于自然分化對照組，Pax2和Nephrin mRNA的表達亦強于自然分化對照組，但無顯著差異，自然分化對照組Lim1 mRNA的表達較強，Wnt4、Sall1、BMP7 mRNA的表達則在2組間相差不大，見圖2。

3后腎細胞微環(huán)境促進EBs細胞表達Pax2和WT-1蛋白

與后腎細胞共培養(yǎng)的第3 d，即可見少數(shù)EBs細胞表達Pax2，而未見WT-1陽性表達細胞；與后腎細胞共培養(yǎng)的第5 d可見Pax2陽性細胞增多，亦見部分WT-1陽性細胞；隨著共培養(yǎng)天數(shù)的延長，Pax2和WT-1陽性細胞數(shù)逐漸增多并成簇分布，且在Pax2陽性細胞中，有部分細胞呈現(xiàn)“指環(huán)”樣排列，見圖3。在自然分化對照組EBs中，未見Pax2或WT1陽性細胞。表明后腎細胞微環(huán)境可促進EBs細胞表達Pax2和WT-1。

Figure 2. mRNA expression of the genes involved in kidney development in EBs cells(RT-PCR). A: 1: EBs cells co-cultured with metanephric cells for 3 d; 2: EBs cells natural differentiated for 3 d; 3: primary cultured E12.5 d metanephric cells. B: relative expression level.*P<0.05,△P<0.01vsEBs cells natural differentiated group.

圖2EBs細胞腎發(fā)育相關(guān)基因的表達

Figure 3. Pax2 and WT-1 positive cells in EBs cells. A-C: Pax2 positive cells emerged in EBs cells after 3 d co-culture(×200); J-L: WT-1 positive cells emerged in EBs cells after 5 d co-culture(×200); G-I(×200), M-O(×400) and P-R(×200): Pax2 and WT-1 positive cells number increased in EBs cells after 5 or 7 d co-culture. S-X: no Pax2 or WT-1 positive cells showed up in control groups.

圖3EBs細胞Pax2和WT-1的表達

討 論

由于腎臟組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有關(guān)ESCs向腎臟細胞分化的研究起步相對較晚。研究報道ESCs可向腎臟細胞分化，但調(diào)控ESCs向各種腎臟分化的關(guān)鍵因素及調(diào)控途徑尚不清楚[1-3]。胚胎干細胞的定向分化與其所處的微環(huán)境有關(guān)，通過細胞共培養(yǎng)或提取細胞培養(yǎng)液的方法模擬發(fā)育所需微環(huán)境，研究者已經(jīng)成功將ESCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細胞[4]、心肌細胞[5]、造血干細胞[6]等。哺乳動物成體腎臟發(fā)育來自后腎，后腎包括后腎間充質(zhì)和輸尿管芽兩部分，二者相互誘導(dǎo)最終形成成體腎，因此胚胎后腎細胞可能具有誘導(dǎo)ESCs分化成為腎臟細胞的能力。本研究將ESCs形成的EBs細胞與E12.5 d的后腎細胞進行共培養(yǎng)，體外模擬腎臟發(fā)育微環(huán)境，探討胚胎腎發(fā)育微環(huán)境定向誘導(dǎo)ESCs向腎細胞分化的作用，為進一步研究ESCs向腎臟細胞分化的機制及建立高效誘導(dǎo)ESCs向腎臟細胞定向分化的方法奠定實驗基礎(chǔ)。

本實驗檢測了12種腎臟發(fā)育相關(guān)基因，其中Pax2、Lim1、Sall1和WT-1基因是在后腎發(fā)育早期即后腎胚芽開始出現(xiàn)時的作用基因；后腎發(fā)育中期一般指從輸尿管芽長入后腎間充質(zhì)區(qū)，到二者相互誘導(dǎo)發(fā)生comma-和S-形形變的過程，GDNF、Emx2、Wnt4和BMP-7基因在此期間發(fā)揮了重要作用；而Nephl、Nehprin和KSP基因主要作用于后腎發(fā)育晚期，三者也在成熟腎臟小管上皮細胞上表達。此外，本實驗還檢測了腎臟祖細胞標志物CD24 mRNA的表達變化[7]。實驗結(jié)果顯示，與后腎細胞共培養(yǎng)后的ESCs表達所檢測的與腎臟發(fā)育相關(guān)的12種基因，其中Pax2、WT-1、Emx2、GDNF、Nephl、Nephrin、KSP和CD24 mRNA的表達強于自然分化對照組，說明胚胎后腎微環(huán)境可促進ESCs表達腎臟發(fā)育相關(guān)基因。免疫熒光實驗結(jié)果還顯示，與后腎細胞共培養(yǎng)后的ESCs表達腎臟細胞標志蛋白Pax2和 WT-1，且部分Pax2陽性細胞呈現(xiàn)“指環(huán)”樣排列，而自然分化對照組未見Pax2或WT1陽性細胞。表明胚胎后腎細胞微環(huán)境可促進ESCs向腎臟細胞分化。本研究結(jié)果顯示ESCs在自然分化條件下亦表達腎臟發(fā)育相關(guān)基因，與Kramer等[8]的報道類似，說明ESCs形成EBs過程中已具備向內(nèi)胚層細胞分化的潛能。進一步篩選胚胎后腎細胞微環(huán)境中促進ESCs向腎臟細胞分化的關(guān)鍵因子并深入探討其作用途徑，對于將來精確調(diào)控ESCs向腎臟各種細胞的分化具有重要意義。

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Metanephriccellmicroenvironmentinducesembryonicstemcellstodifferentiatetowardrenalcells

WANG Yang, ZHANG Li-xing, WANG Gong-xian, XIE An, LOU Yuan-lei, RUAN Qiong-fang, CUI Su-ping, YANG Yang

(InstituteofUrology,NanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:wangy63cn@sina.com)

AIM: To explore the effects of metanephric cell microenvironment on inducing embryonic stem cells (ESCs) to differentiate toward renal cells.METHODSEmbryoid bodies (EBs) of D3 mouse embryonic stem cells were prepared by hanging drop culture, and the EBs were co-cultured indirectly with metanephric cells derived from E12.5 d mouse embryo. The EBs cell with spontaneous differentiation was used as the control. The proteins of Pax2 and WT-1 were analyzed by immunofluorescence assay. The mRNA expression of Pax2, WT-1, Lim1, Sall1, Emx2, GDNF, Wnt4, BMP7, Nephl, Nephrin, KSP and CD24 genes was detected by RT- PCR.RESULTSThe genes related to kidney development were expressed in the EBs cells after co-culture on day 3, and the mRNA expression of Pax2, WT-1, Emx2, GDNF, Nephl, Nephrin, KSP and CD24 was stronger than those in control group. Pax2 positive cells were found on day 3 in the co-cultured EBs cells, and the positive cells increased on day 5 and day 7. WT-1 protein positive cells were found in the co-cultured EBs cells on day 5. No Pax2 or WT-1 positive cell was observed in control group.CONCLUSIONMetanephric cell microenvironment promotes ESCs differentiation toward renal cells.

Embryonic stem cells; Metanephric cells; Renal cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.025

1000-4718(2011)01-0129-05

2010-07-28

2010-10-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30960385)；江西省自然科學(xué)基金資助項目(No. 2007GZY1470)

△通訊作者 Tel：0791-8692527； E-mail： wangy63cn@sina.com