陳 莉， 王紅祥， 趙 湜， 李 娜， 張文靜， 丁 勝

(武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430014)

高游離脂肪酸通過FOXO1途徑抑制內(nèi)皮祖細胞增殖并促進其凋亡*

陳 莉， 王紅祥△， 趙 湜， 李 娜， 張文靜， 丁 勝

(武漢市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 武漢 430014)

目的研究高游離脂肪酸(FFA)對糖尿病患者內(nèi)皮祖細胞(EPCs)增殖及凋亡的影響，評價FFA在糖尿病血管并發(fā)癥中的可能作用。方法分離培養(yǎng)2型糖尿病患者EPCs(DM組)和正常對照組EPCs(對照組)，加入不同濃度(0、10和50 mmol/L)的FFA。MTT法檢測EPCs增殖，Annexin-V/PI法檢測其凋亡。RT-PCR法和Western blotting法檢測核轉(zhuǎn)錄因子FOXO1的表達水平。結(jié)果隨著FFA濃度的增加，DM組和對照組EPCs增殖率明顯下降，而凋亡率明顯增加，差異均顯著(P<0.05)。相同F(xiàn)FA濃度下，DM組增殖率低于對照組(P<0.05)。隨著FFA濃度的增加，DM組和對照組FOXO1的mRNA表達逐漸降低，差異顯著(P<0.05)。結(jié)論高FFA可能通過FOXO1途徑抑制EPCs增殖并誘導(dǎo)其凋亡，可能在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生中發(fā)揮作用。

游離脂肪酸; 內(nèi)皮祖細胞; 細胞增殖; 細胞凋亡; 叉頭框O1蛋白

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝綜合征。血管并發(fā)癥是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響了糖尿病患者的生活質(zhì)量，其發(fā)生與血管內(nèi)皮細胞及其前體細胞內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)相關(guān)。高游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)作為糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生中的重要環(huán)節(jié)，對血管內(nèi)皮細胞的作用已經(jīng)有較多研究，但其對EPCs的影響及其機制均不清楚。為此，本研究將FFA作用于EPCs，觀察其增殖及凋亡的變化，并檢測核轉(zhuǎn)錄因子叉頭框O1(forkhead box O1，F(xiàn)OXO1)蛋白的表達，以進一步了解糖尿病血管并發(fā)癥中FFA所起的作用，為其防治提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

M199培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco。牛血清白蛋白(bouvine serum albumin, BSA)和疊氮化鈉購自Sigma。25 cm2培養(yǎng)瓶及各種培養(yǎng)板、離心管均購自Corning。MTT購自華美生物工程公司。胰蛋白酶購自上海生工生物工程公司。淋巴細胞分離液購自上海生化試劑二廠(比重1.077)。人纖維連接蛋白(human fibronectin, HFN)購自Chemicon。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)購自Peprotech。FITC標(biāo)記抗CD34抗體和抗CD133抗體購自BD。Trizol購自Invitrogen，cDNA第1鏈合成試劑盒、TaqDNA聚合酶和dNTP購自Fermentas。引物由北京奧科公司合成。

2對象與分組

32例2型糖尿病患者(DM組)均符合1999年WHO糖尿病診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)，男21例，女11例，平均年齡(45.1±11.7)歲，體重指數(shù)(26.3±12.5)kg/m2，糖尿病病程平均(14.8±8.4)年，糖化血紅蛋白(8.2%±2.5%)，其中吸煙13例。對照組20例為來院體檢的健康人，男14例，女6例，平均年齡(44.4±10.2)歲，體重指數(shù)(24.2±8.7)kg/m2。2組年齡和體重指數(shù)經(jīng)t檢驗，差異無顯著(P>0.05)。2組均排除了各種感染、潰瘍或近期手術(shù)等可能影響EPCs和導(dǎo)致周圍血管并發(fā)癥的情況[1]。

3FFA的配制

取棕櫚酸，用乙醇配制成100 mmol/L的濃度；取牛血清白蛋白，用蒸餾水配制成10% BSA溶液；取50 μL 100 mmol/L棕櫚酸溶液，加入上述10%BSA溶液中，在55 ℃水浴中靜置15 min，直至溶液澄清，-20 ℃保存。臨用前在55 ℃水浴放置至澄清。

4EPCs的培養(yǎng)

EPCs的培養(yǎng)及鑒定參照文獻[2]。簡述如下。取空腹外周靜脈血15 mL，常規(guī)密度梯度離心法獲取單個核細胞，并懸浮于5 mL M199 培養(yǎng)基(含20%胎牛血清、VEGF 10 μg/L、bFGF 2 μg/L、EGF 5 μg/L、青霉素1×105μ/L、鏈霉素100 mg/L)中，將其鋪在纖維連接蛋白包被20 min的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃、飽和濕度、5%CO2溫箱中培養(yǎng)4 d。然后以M199培養(yǎng)基輕輕洗去未貼壁細胞，繼續(xù)以上述完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7 d。將DiI-acLDL(2.4 mg/L)加入EPCs培養(yǎng)體系中，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的UEA-I(10 mg/L)，37 ℃繼續(xù)孵育1 h。4%多聚甲醛固定10 min后于熒光顯微鏡下觀察。FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs。

5EPCs增殖能力檢測

分別收集對照組和糖尿病組的EPCs，調(diào)整細胞濃度后將等量EPCs接種到包被有HFN的96孔培養(yǎng)板中，加入FFA，使其濃度分別為0、10和50 mmol/L。以絲裂霉素C處理30min的相同來源的EPCs作為對照，培養(yǎng)20 h，然后每孔加10 μL MTT(5 g/L)，孵育4 h后吸棄上清，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min，選擇490 nm波長，在自動酶聯(lián)檢測儀上測定各孔的吸光度(absorbance,A)值，并計算增殖率。增殖率(%)=(A實驗/A對照-1)×100%

6EPCs凋亡的檢測

分別收集對照組和糖尿病組EPCs，與不同濃度FFA共培養(yǎng)48 h后，用PBS充分洗滌，胰酶消化后分別加入FITC標(biāo)記的Annexin-V和PI溶液(操作按說明書進行)，流式細胞儀檢測，Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析。Annexin-V陽性同時PI陰性的細胞計為早期凋亡細胞，將AnnexinV和PI均為陽性的細胞計為晚期凋亡細胞。計算細胞凋亡率。

7RT-PCR法檢測FOXO1mRNA表達

Trizol一步法提取EPC總RNA，操作按說明書進行。紫外分光光度儀測定RNA的A260/A280值。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，其中5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，核糖核酸酶抑制劑1 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，寡聚T引物1 μL，細胞總RNA 2 μL，M-MLV(逆轉(zhuǎn)錄酶)1 μL，用焦碳酸二乙酯(DEPC)三蒸水補充至20 μL。反應(yīng)條件為42 ℃ 1 h，然后70 ℃10 min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。引物參照GenBank庫中的cDNA序列進行設(shè)計。FOXO1：上游引物5'- GCAACGCGTGGGGCAACCTGT-3'，下游引物5'- GGGCACGCTCTTCACCATCCACTC-3'，擴增片段116 bp。β-actin：上游引物5'- GTGGGGCGCCCCAGGCACCA -3'，下游引物5'- CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC -3'，擴增片段540 bp。反應(yīng)體系25 μL，其中10×PCR緩沖液2.5 μL，cDNA2 μL，TaqDNA 聚合酶1 μL(1 U)，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.2 μmol/L FOXO1及β-actin上游及下游引物各1 μL，25 μmol/L MgCl2溶液2 μL。擴增條件：首次94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)33次，最后72 ℃ 10 min。取擴增產(chǎn)物5 μL，用2%的瓊脂糖凝膠(溴化乙啶濃度為0.5 mg/L)電泳，100 bp DNA為分子量標(biāo)準(zhǔn)，在300 nm紫外光下攝影。

8Westernblotting法檢測FOXO1蛋白表達

應(yīng)用TriPure提取蛋白法提取DM組和對照組EPCs蛋白，定量為2 g/L，每泳道點樣20 μg提取蛋白，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1 h，轉(zhuǎn)膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉后，分別加入小鼠抗人FOXO1單克隆抗體(1∶100)和小鼠抗人β-actin抗體(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，再加入兔抗小鼠IgG(1∶5 000)孵育1 h，最后經(jīng)ECL系統(tǒng)曝光顯影，通過凝膠分析系統(tǒng)分析蛋白的表達。

9統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1EPCs增殖率的檢測

與未加FFA組相比，隨著FFA濃度的增加，DM組和對照組EPCs增殖率均明顯下降，差異顯著(P<0.05)。而相同F(xiàn)FA濃度下，DM組增殖率低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1不同濃度的FFA對DM組和對照組EPCs增殖率的影響

GroupnFFA(mmol/L)01050Control2017．8±3．214．3±3．7??9．4±2．6??DM3215．2±3．110．4±3．5??△△5．5±2．4??△△

**P<0.01vsFFA 0 mmol/L;△△P<0.01vscontrol.

2EPCs凋亡的檢測

隨著FFA濃度的增加，DM組和對照組EPCs早期和晚期凋亡率均增加，差異顯著(P<0.05)。而相同F(xiàn)FA濃度下，DM組早期和晚期凋亡率亦高于對照組，差異顯著(P<0.05),見表2。

表2不同濃度的FFA對DM組和對照組EPCs凋亡率的影響

GroupnApoptotictypeFFA(mmol/L)01050Control20Early3．6±1．65．5±3．0??11．3±6．1??Late4．7±2．46．3±3．6??10．2±3．2??DM32Early4．1±2．06．5±2．8??14．5±5．4??△Late3．2±1．18．8±3．4??△12．3±5．0??△

**P<0.01vsFFA 0 mmol/L;△P<0.05vscontrol.

3FOXO1的mRNA和蛋白表達

RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著FFA濃度的增加，DM組和對照組FOXO1的mRNA表達逐漸降低，差異顯著(P<0.05)，見表3、圖1。Western blotting法檢測發(fā)現(xiàn)，隨著FFA濃度的增加，F(xiàn)OXO1蛋白表達逐漸下降,見表4、圖2。

表3不同濃度的FFA對DM組和對照組EPCs中FOXO1mRNA表達的影響

GroupnFFA(mmol/L)01050Control200．90±0．110．65±0．09??0．41±0．14??DM320．80±0．130．52±0．11??0．31±0．20??

**P<0.01vsFFA 0 mmol/L.

Figure 1. Expression of FOXO1 mRNA in EPCs treated with various concentrations of FFA (Lane 1, 4: 0 mmol/L; Lane 2, 5: 10 mmol/L; Lane 3, 6: 50 mmol/L) in control group (Lane 1-3) and DM group (Lane 4-6). M: 100 bp DNA marker from 100 to 600 bp.

圖1不同濃度的FFA對EPCs中FOXO1mRNA表達的影響

表4不同濃度的FFA對DM組EPCs中FOXO1蛋白表達的影響

FFA(mmol/L)FOXO1/β-actin00．85±0．17100．47±0．15?500．22±0．12?

*P<0.05vsFFA 0 mmol/L.

Figure 2. Expression of FOXO1 protein in EPCs treated with various concentrations of FFA in DM group.

圖2不同濃度的FFA對DM組EPCs中FOXO1蛋白表達的影響

討 論

本研究將FFA作用于糖尿病患者EPCs，觀察對其增殖、凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA可抑制EPCs增殖，促進其凋亡，且這些作用具有劑量依賴性。FFA是細胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和前列腺素合成的供體，也是脂肪代謝的中間產(chǎn)物。許多研究表明高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗在糖尿病的發(fā)生中起到重要作用[3]，但FFA與糖尿病周圍血管病的關(guān)系研究較少。而糖尿病周圍血管病作為糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，其發(fā)生與EPCs關(guān)系密切[4]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)FA可抑制EPCs的增殖，在糖尿病周圍血管病的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。

在脂肪和肌肉組織中，過氧化物酶增殖體激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR)家族和FOXO家族是維持血糖穩(wěn)定和胰島素敏感性的2個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子家族[5]。FOXO轉(zhuǎn)錄因子位于細胞核內(nèi)，在沒有胰島素存在情況下能夠促進細胞內(nèi)葡萄糖合成關(guān)鍵酶的合成，而在胰島素的作用下，通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)途徑，磷酸化后移出細胞核，阻斷其促進葡萄糖生成酶的作用，從而中止葡萄糖的合成[6]。FOXO轉(zhuǎn)錄因子還在氧化應(yīng)激[7-9]和清除自由基方面發(fā)揮作用[10，11]，其下游基因包括保護細胞免受過氧化的錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)等[12]。2型糖尿病患者體內(nèi)一般存在高FFA，這種狀態(tài)對糖尿病患者的心肌細胞功能可造成不良影響[13]，還有報道高FFA可抑制脂肪細胞表達FOXO1[14]，但對EPCs的作用尚未見報道。

為此，我們研究了在高FFA作用下EPCs表達FOXO1的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著FFA濃度的增加，EPCs中FOXO1的表達逐漸減低。FFA增加，線粒體內(nèi)游離自由基的合成也隨之增加，氧化應(yīng)激增強；同時FOXO1表達減弱，下游清除自由基的分子如MnSOD合成減少，兩方面綜合作用，可能損害EPCs。還有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO的功能與周圍血管功能密切相關(guān)。當(dāng)缺乏FOXO時，血管內(nèi)皮細胞失去了對VEGF的反應(yīng)性[15]，且血管平滑肌細胞持續(xù)增殖，使血管壓力增高，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損[16]。本研究結(jié)果還提示，高FFA情況下，EPCs的凋亡也增加，因此FOXO表達減弱是由于EPCs凋亡增加引起，還是由于FFA的直接作用，尚待進一步探討。

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FreefattyacidinhibitsproliferationandpromotesapoptosisofendothelialprogenitorcellsviaFOXO1pathway

CHEN Li, WANG Hong-xiang, ZHAO Shi, LI Na, ZHANG Wen-jing, DING Sheng

(DepartmentofEndocrinology,WuhanCentralHospital,Wuhan430014,China.E-mail:whitely1972@sina.com)

AIM: To investigate the effect of free fatty acid (FFA) on endothelial progenitor cells (EPCs), and to elucidate the role of FFA in the pathogenesis of diabetic peripheral vascular disease.METHODSEPCs were isolated from the patients with type 2 diabetes mellitus (DM group) and normal healthy persons (control group). Various concentrations of FFA were added to the culturing system. MTT assay was used to detect the proliferative rate. Apoptotic rate of EPCs was measured by Annexin V/PI assay. The expression of FOXO1 was determined by RT-PCR and Western blotting.RESULTSIn a dose-dependent manner, FFA attenuated the proliferative activity of EPCs in both control group and DM group, while increased the apoptotic rates (P<0.05). The expression of FOXO1 decreased under the condition of FFA exposure and the difference was significant (P<0.05).CONCLUSIONFFA may be a new factor in the pathogenesis of diabetic peripheral vascular disease through FOXO1 pathway.

Free fatty acids; Endothelial progenitor Cells; cell proliferation; Apoptosis; Forkhead box O1 protein

R363

A

1000-4718(2011)08-1615-04

2010-12-16

2011-06-20

湖北省衛(wèi)生廳科研資助項目(No. JX3A24)

△通訊作者Tel：027-82211474；E-mail: whitely1972@sina.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.08.029