鄭曉宇，李 建，方曉江，陳可泉，奚永蘭，姜 岷

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 210009）

研究開發(fā)

金屬離子對產琥珀酸放線桿菌NJ113厭氧發(fā)酵代謝的影響

鄭曉宇，李 建，方曉江，陳可泉，奚永蘭，姜 岷

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇 南京 210009）

考察了培養(yǎng)基中分別添加Mg2+、Mn2+、Co2+3種金屬離子對Actinobacillus succinogenesNJ113菌體生長及產酸的影響，并進行了代謝通量分析。結果表明培養(yǎng)基中分別添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+、2 mmol/L Co2+后流向HMP途徑的通量r17比對照組分別提高了445.38%、176.23 %和171.67%，使得還原力不足的矛盾得到緩解；流向C4途徑的通量r13比對照組分別提高了57.70%、15.94%和2.91%；最終使得流向丁二酸的通量r16比對照組分別提高了 62.69%、18.91%和 5.01%。此外，關鍵酶活分析結果顯示分別添加 Mg2+、Mn2+以及 Co2+后，PEP羧化激酶（Pck）比活力由對照組的339.18 U/mg分別提高到568.732 U/mg、728.049 U/mg和339.686 U/mg。最終當培養(yǎng)基中分別添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+、2 mmol/L Co2+后丁二酸產量分別為27.83 g/L、26.27 g/L和23.54 g/L，比對照的22.79 g/L分別提高22.11%、15.27%以及3.4%。

產琥珀酸放線桿菌NJ113；丁二酸；Mg2+、Mn2+、Co2+；代謝通量分析

丁二酸（俗名琥珀酸）是生物煉制產品工程中優(yōu)秀的碳四平臺化合物，其可以作為許多重要的中間產物和專業(yè)化學制品。傳統(tǒng)的生產方法是采用石化法，污染大，成本高，嚴重抑制了丁二酸作為大宗化學品的發(fā)展?jié)摿?。隨著生物工程技術的迅速發(fā)展和成熟，生物轉化法生產丁二酸由于其高效率、環(huán)保性以及原料的可再生性而引起許多研究者的注意[1-2]。

產琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）是從瘤胃中篩選出的丁二酸高產菌株，McKlinlay等[3]利用13C原子標記確定了產琥珀酸放線桿菌的代謝途徑，結果表明磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）是代謝過程中的一個重要節(jié)點，而代謝途徑中關鍵酶則是磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（Pck）和丙酮酸激酶（Pyk）[4-5]。一方面Pck催化PEP生成草酰乙酸（OAA），進而合成丁二酸；另一方面PEP又在Pyk的催化下生成丙酮酸（PYR），進而生成甲酸、乙酸等副產物。因此這兩個過程所占通量比例大小直接影響丁二酸的產量，而Pck和Pyk這兩種酶的酶活直接影響了這兩個通量的比例。影響Pck和Pyk酶活的因素有很多，除了發(fā)酵液中的CO2[6-7]和發(fā)酵液pH值[8]會對兩種酶的酶活有影響外，一些二價金屬離子也會對兩者有影響。國內外眾多研究者[9-13]對Pck進行生化特性分析發(fā)現(xiàn)，Mg2+、Mn2+和Co2+對Pck酶活有明顯的激活作用。

作者利用實驗室篩選的一株丁二酸高產菌Actinobacillus succinogenesNJ113，從代謝通量分析角度，考察適量添加 Mg2+、Mn2+和 Co2+對A. succinogenesNJ113代謝通量分布及關鍵節(jié)點的影響，并結合關鍵酶酶活分析說明其影響機理，為優(yōu)化發(fā)酵過程提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 生產菌株

Actinobacillus succinogenesNJ113（本實驗室篩選并保存）。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基

葡萄糖 10 g/L（分開滅菌），酵母膏 5 g/L，玉米漿干粉 2.5 g/L，NaHCO310 g/L，NaH2PO4·2H2O 9.6 g/L，K2HPO4·3H2O 15.5 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖 40 g/L（分開滅菌），酵母膏 10 g/L，玉米漿干粉 7.5 g/L，乙酸鈉 1.36 g/L，K2HPO43 g/L，NaCl 1 g/L，CaCl20.2 g/L，NaH2PO4·2H2O 1.6 g/L，Na2HPO4·3H2O 0.31 g/L，121 ℃滅菌15 min。

1.3 培養(yǎng)方法

種子用100 mL血清瓶培養(yǎng)，裝液量50 mL，接種量2 %，于37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)10 h；3 L（BioFlo 110 fermentor；New Brunswick Scientific Co.，Edison，N.J.）發(fā)酵罐裝液量1.5 L，接種量7 %（體積分數(shù)），在37 ℃、攪拌轉速200 r/min、CO2通氣量0.5 L/min、以25% Na2CO3為pH值調節(jié)劑維持pH值在6.8。

1.4 分析方法

1.4.1 葡萄糖含量的測定

生物傳感分析儀（SBA240C，山東省科學院生物研究所）。

1.4.2 菌體密度的測定

將發(fā)酵液用去離子水稀釋適當倍數(shù)，使A660值在0.2～0.8之間，用紫外可見分光光度計測定。菌液濁度OD660=A660×稀釋倍數(shù)。

1.4.3 細胞干重的測定

稱出干燥10 mL離心管質量（G1），取5 mL發(fā)酵液置于離心管中，9000 r/min離心5 min，棄上清液；再用5 mL生理鹽水清洗兩次，離心，于60 ℃烘箱中干燥至恒重，稱重（G2），則細胞干重DCW＝(G2－G1)/5。

1.4.4 產物含量的測定

采用高效液相色譜法（HPLC），色譜柱為Aminex? HPX-87H型離子排斥色譜柱（300 mm ×φ7.8 mm，5 μm），流動相為5 mmol/L H2SO4水溶液，流速0.6 mL/min，進樣體積20 μL，柱溫55 ℃，丁二酸、乙酸、甲酸、乳酸等利用紫外檢測器檢測，檢測波長為215 nm，乙醇利用折光示差檢測器檢測[14]。

1.4.5 酶活的測定

細胞提取液的制備：取5 mL發(fā)酵液于10 mL離心管中，8000 r/min、4 ℃離心5 min，棄去上清液，用5 mL Tris-HCl（0.1 mol/L，pH值7.0）溶液洗滌兩次后將細胞懸浮，置于冰槽中超聲破碎 20 min；結束后8000 r/min、4 ℃離心5 min，將上清液轉入另一離心管中，保存在－80 ℃冰箱內待用。

蛋白質濃度的測定：Bradford法，以牛血清白蛋白作為標準[15]。

Pck酶活測定體系：0.3 mol/L Tris-HCl（pH值6.6），0.3 mol/L MgCl2，0.15 mol/L MnCl2，1.125 mol/L NaHCO3，12 U/mL 蘋果酸脫氫酶，0.1 mol/L ADP·Na2，3 mmol/L煙酰胺腺嘌吟二核苷酸（NADH），0.15 mol/L PEP，細胞提取液；所有底物于37 ℃水浴20 min，然后采用聯(lián)機紫外可見分光光度計于340 nm處測定反應的初速度。

Pyk酶活測定體系：0.3 mol/L Tris-HCl（pH值7.5），0.3 mol/L MgCl2，0.75 mol/L KCl， 12 U/mL 乳酸脫氫酶，0.1 mol/L ADP·Na2，3 mmol/L NADH，0.15 mol/L PEP，細胞提取液；所有底物于37 ℃水浴 20 min，然后采用聯(lián)機紫外可見分光光度計于340 nm處測定反應的初速度。

一個酶活力單位（U）定義為1 min催化1 nmol底物轉化為產物的量；比活力為每mg蛋白質所含的酶活力單位數(shù)。

式中，V為反應體系體積，mL；ε為摩爾消光系數(shù)，cm2/mol；v為樣品量，mL；L為比色杯光徑，cm；ΔA為吸光度變化、109為將mol換算成nmol。

1.4.6 代謝過程及通量分析

利用姜岷等[16]建立的A. succinogenesNJ113以葡萄糖作為碳源合成丁二酸的代謝網絡和代謝通量計算方法，采用擬穩(wěn)態(tài)假設，根據(jù)發(fā)酵過程中葡萄糖消耗速率，丁二酸、甲酸、乙酸、乳酸、乙醇以及生物量的合成速率（r1、r16、r11、r9、r10、r12、rBM），并利用 MATLAB軟件計算出各個途徑的代謝通量。整個代謝網絡包括24個代謝反應方程，18種代謝中間產物，見表1、表2。

表1 代謝反應方程

續(xù)表

表2 代謝通量方程

2 結果與討論

2.1 添加不同濃度的金屬離子對發(fā)酵的影響

本實驗在100 mL血清瓶中發(fā)酵考察培養(yǎng)基中添加不同濃度的 Mg2+、Mn2+及 Co2+，在初始葡萄糖濃度為20 g/L時對菌體產丁二酸的影響，結果見表3。

由表3可以看出，添加不同金屬離子對丁二酸產量都有一定的影響。其中添加Mg2+、Mn2+對產酸均有一定的促進作用，其中添加Mg2+的效果最好，Mn2+其次，Co2+影響最小。當Mg2+離子添加濃度為6 mmol/L時，丁二酸產量達16.71 g/L，丁二酸收率達到 83.55%，較對照提高 25.9%；當Mn2+離子添加濃度為6 mmol/L時，丁二酸產量達15.36 g/L，丁二酸收率達 76.80%，較對照提高19.2%；當Co2+離子添加濃度為2 mmol/L時，丁二酸產量達到最大，為 12.39 g/L，丁二酸收率達61.95%，較對照組提高4.3%。而繼續(xù)增加離子濃度對菌體生長及丁二酸產量有一定的抑制作用，甚至出現(xiàn)下降趨勢。

表3 添加不同金屬離子對發(fā)酵的影響

2.2 添加不同金屬離子對發(fā)酵結果的影響

在3 L罐中分別考察初糖濃度為40 g/L時培養(yǎng)基中分別添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+以及2 mmol/L Co2+對A. succinogenesNJ113厭氧發(fā)酵制備丁二酸的影響，結果見圖1。

從圖1可以看出添加不同金屬離子對菌體生長和丁二酸產量均有一定的影響。其中培養(yǎng)基中添加6 mmol/L Mn2+菌體最高OD達11.93，較對照的9.46增加26.1%，培養(yǎng)基中添加6 mmol/L Mg2+時菌體最高OD達10.33，比對照提高9.1%，另外當培養(yǎng)基中添加2 mmol/L Co2+菌體最高OD為9.80，雖然僅與對照相差不大，但是其穩(wěn)定期維持時間較長，也有利于丁二酸產量的增加。金屬離子對菌體生長的促進作用也使得丁二酸產量的提高，培養(yǎng)基中未添加金屬離子時丁二酸的產量為22.79 g/L，當培養(yǎng)基中分別添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+以及2 mmol/L Co2+時丁二酸最終產量分別為27.83 g/L、26.27 g/L和23.54 g/L，比對照分別提高22.11%、15.27%以及3.40%。

2.3 添加不同金屬離子對代謝通量分布的影響

圖2為A. succinogenesNJ113代謝途徑，代謝通量分析可以直觀地反映細胞的代謝能力[17]。對A. succinogenesNJ113進行代謝通量分析，分別選擇在9 h、9.5 h、10 h、10.5 h、11 h（即穩(wěn)定期）取樣分析發(fā)酵液中的細胞干重、葡萄糖、丁二酸、乙酸、甲酸、乳酸以及乙醇的濃度，得到在10 h時的單位時間濃度變化率[mmol/(gDCW·h)]，并計算得到各反應的代謝通量。添加不同金屬離子后代謝通量分布情況見表4。

由表4可以看出在發(fā)酵穩(wěn)定期（10 h），添加6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+時生物量通量分別為25.76 mmol/(gDCW·h)、25.66 mmol/(gDCW·h)，與對照24.89 mmol/(gDCW·h)相差不大；當培養(yǎng)基中添加 2 mmol/LCo2+時生物量通量為 37.28 mmol/(gDCW·h)，比對照提高了49.78%，使得發(fā)酵穩(wěn)定期延長。

圖1 添加不同金屬離子對A. succinogenes NJ113發(fā)酵過程的影響

圖2 A. succinogenes NJ113的代謝途徑

表4 不同金屬離子對代謝通量分布的影響

通量變化主要在糖酵解途徑（EMP）（r2）、磷酸戊糖途徑（HMP）（r17）、C3（r6）及C4（r13）途徑的摩爾通量上，其中PEP是影響丁二酸合成的關鍵節(jié)點，PYR是影響乙酸、甲酸等副產物生成的關鍵節(jié)點。培養(yǎng)基中添加金屬離子Mg2+、Mn2+、Co2+后流向HMP與EMP途徑的通量比（r17∶r2）分別為45.43∶54.23、23.01∶75.71和22.69∶76.04，而對照的r17∶r2僅為8.33∶88.54。丁二酸生成過程中，菌體通過EMP途徑將1 mol葡萄糖生成2 mol PEP的同時生成2 mol NADH，但是2 mol PEP生成2 mol丁二酸的同時則需消耗4 mol NADH，乙酸、甲酸等副產物的生成過程未涉及 NADH的消耗和生成，可見，丁二酸合成過程中存在還原力不足的現(xiàn)象；而HMP途徑中1 mol G6P生成1 mol RL5P的同時生成 2 mol煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），2 mol NADPH能生成2 mol NADH。因此，HMP途徑通量r17越大越有利于菌體代謝過程中還原力[H]的生成，進而有利于丁二酸的產生，由代謝通量分布看出，培養(yǎng)基中添加這3種金屬離子均使得HMP途徑通量比提高，其中添加Mg2+時 HMP途徑通量比最高，Mn2+次之，Co2+最低。

此外培養(yǎng)基中分別添加Mg2+、Mn2+、Co2+后流向 C4途徑的通量r13分別為 160.14 mmol/（gDCW·h）、117.74 mmol/（gDCW·h）、104.51mmol/（gDCW·h），比對照組分別提高了57.70%、15.94%和2.91%；丁二酸代謝通量r16分別為157.83 mmol/（gDCW·h）、115.35 mmol/（gDCW·h）和 101.87 mmol/（gDCW·h），與對照組丁二酸通量97.01 mmol/（gDCW·h）相比，分別提高了62.69%、18.90%和5.01%。同時，培養(yǎng)基中分別添加6 mmol/L Mn2+、6 mmol/L Mg2+、2 mmol/L Co2+后流向C3途徑的通量r6均有所降低，使得更多的碳源用于合成產物丁二酸，最終提高了丁二酸產量。

2.4 添加不同金屬離子對關鍵酶活的影響

菌體代謝過程中的每一個代謝反應都是由特定的酶催化的，酶活力的大小直接影響各代謝反應速率，進而影響整個代謝網絡的通量分布，因此引起上述代謝通量分布變化的原因可能是這3種二價金屬離子影響了A. succinogenesNJ113代謝過程中的一些關鍵酶尤其是 Pck和 Pyk酶的酶活。Podkovyrov等[9]研究發(fā)現(xiàn)這3種金屬離子對Pck酶活均有影響。本實驗檢測培養(yǎng)基中添加3種金屬離子后對發(fā)酵穩(wěn)定期時（10 h）過程中關鍵酶的酶活，并與對照比較，結果見圖3。

圖3 不同金屬離子對關鍵酶活的影響

由圖3可以看出，這3種金屬離子對Pck和Pyk都有不同程度的影響。Mn2+對Pck和Pyk酶活影響最大，Pck比活力分別由對照組的339.18 U/mg增至728.05 U/mg，提高了135.48%，Pyk比活力由262.34 U/mg增至435.19 U/mg，提高了65.88%，雖然Mn2+使得Pck酶活提高最多，但同時它使得Pyk酶活大大提高，這對C4途徑通量增加是不利的；Mg2+對 Pck酶活影響較大，當培養(yǎng)基中添加Mg2+后 Pck增至 568.73 U/mg，比對照提高了83.95%，Pyk比活力則為282.33 U/mg，比對照提高了7.62%；當培養(yǎng)基中添加Co2+后Pck和Pyk比活力分別達到339.69 U/mg 和273.55 U/mg，與對照相比分別提高了 9.87%和 4.27%。顯然這 3種二價金屬離子均有利于提高Pck酶活，進而使得進入C4途徑的通量增加，進入 C3途徑的通量減少，最終合成更多的丁二酸，同時降低乙酸、甲酸等副產物的產量。經過比較，在培養(yǎng)基中添加 Mn2+在提高 Pck酶活的同時也提高了 Pyk酶活，不利于提高C4途徑通量，進而影響丁二酸產量；而Mg2+在提高Pck酶活的同時對Pyk酶活的影響不大，因此 Mg2+最有利于A.succinogenesNJ113產丁二酸。

3 結 論

添加上述3種二價金屬離子對菌體生長及發(fā)酵產丁二酸均有一定的影響，并且均有利于A. succinogenesNJ113 產丁二酸。通過代謝通量分析方法，結果表明培養(yǎng)基中分別添 Mg2+、Mn2+以及Co2+后流向HMP途徑的通量r17和流向C4途徑的通量r13較對照都有不同程度提高，最終導致流向丁二酸的通量r16提高。此外，關鍵酶活分析結果顯示Mg2+、Mn2+以及Co2+對Pck和Pyk酶活均有不同程度的影響，其中Co2+對Pck和Pyk酶活均有提高，但影響最??；Mn2+在提高Pck酶活的同時也使得 Pyk酶活大大提高，這對 C4途徑通量增加是不利的；Mg2+在提高Pck酶活的同時對Pyk酶活的影響不大，因此最有利于A.succinogenesNJ113產丁二酸。最終當培養(yǎng)基中分別添加 6 mmol/L Mg2+、6 mmol/L Mn2+、2 mmol/L Co2+后丁二酸產量分別為27.83 g/L、26.27 g/L、和23.54 g/L，比對照的22.79 g/L分別提高22.11%、15.27%以及3.4%。

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Effect of metal ions on fermentation and metabolization ofActinobacillus SuccinogenesNJ113

ZHENG Xiaoyu，LI Jian，F(xiàn)ANG Xiaojiang，CHEN Kequan，XI Yonglan，JIANG Min
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，Jiangsu，China）

The effects of adding Mg2+，Mn2+，Co2+on cell growth and succinic acid production was investigated. The metabolic flux ofActinobacillus succinogenesNJ113 was calculated. It was found that the flux of HMP increased by 445.38%，176.23 % and 171.67% after adding 6 mmol/L Mg2+，6 mmol/L Mn2+， 2 mmol/L Co2+respectively，thus the reducing power was better balanced. The flux of C4was 57.70%，15.94% and 2.91% higher respectively，which led to the improvement of succinic acid flux by 62.69%，18.91% and 5.01%. The key enzyme activity analysis showed that the specific activity of PEP carboxykinase（Pck）reached 568.732 U/mg，728.049 U/mg and 339.686 U/mg with 6 mmol/L Mg2+，6 mmol/L Mn2+，2 mmol/L Co2+addition respectively. As a result，the concentration of succinc acid was 27.83 g/L，26.27 g/L，and 23.54 g/L，while the concentration of control was only 22.79 g/L.

Actinobaccilus succinogenesNJ113；succinic acid；Mg2+，Mn2+，Co2+；metabolic flux analysis

T 921

A

1000–6613（2011）07–1591–07

2010-12-21；修改稿日期：2011-02-18。

國家 973計劃（2011CB707405）、國家自然科學基金（21076105）、材料化學工程國家重點實驗室基金及江蘇省“青藍工程”共同資助項目。

鄭曉宇（1986—），女，碩士研究生。E-mail zhengxiaoyu123 @sina.cn。聯(lián)系人：姜岷，教授。E-mail bioengine@njut.edu.cn。