任環(huán)宇，唐修文

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與遺傳學(xué)系，浙江杭州310058)

芹菜素是一種低毒、非誘變性的黃酮類物質(zhì)［1］，存在于許多水果和蔬菜(大白菜、青椒、大蒜、芹菜和番石榴等)中［2］。研究報道，芹菜素具有預(yù)防腫瘤的作用。在體外細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤模型中，其可以促進(jìn)金屬螯合，清除自由基以及激活Ⅱ相解毒酶［3］;在鼠皮膚和結(jié)腸癌模型中證明，其具有保護(hù)組織對致癌物質(zhì)的侵襲［4-5］。芹菜素是鳥氨酸脫羧酶的強(qiáng)抑制劑，而該酶在腫瘤誘發(fā)中起關(guān)鍵作用，局部應(yīng)用芹菜素可以抑制二甲基苯并蒽誘導(dǎo)的皮膚癌［6］。芹菜素還可降低紫外線誘導(dǎo)的癌癥發(fā)生率［4］。在吸煙人群中，芹菜素等黃酮類化合物的攝入與肺癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)［7］。據(jù)報道，芹菜素可抑制人宮頸癌hela細(xì)胞［8］、前列腺癌CA-HPV-10［9］細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的增殖，在體內(nèi)或體外抑制多種腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和侵襲［10-14］，誘導(dǎo)乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和白血病細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯和凋亡［9，15-18］。芹菜素可抑制人類前列腺癌PC-3細(xì)胞、人類卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞以及乳腺癌ZR-75-30細(xì)胞在動物模型中腫瘤的血管生成［10，14，19］。尤其是，芹菜素可以顯著地抑制前列腺癌CA-HPV-10細(xì)胞的生長，而對人類正常前列腺上皮細(xì)胞抑制作用很弱，表現(xiàn)出特異性抗腫瘤作用。類似的選擇性抑制效應(yīng)也被發(fā)現(xiàn)于人類鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞和人類正常表皮角質(zhì)化細(xì)胞中［9］;并 且，芹 菜 素 可 增 強(qiáng) TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，如人類急性淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞、人類前列腺癌DU145細(xì)胞和人類結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞，而對正常的人類外周血單核細(xì)胞無增強(qiáng)作用［2］。芹菜素也可以增強(qiáng)順鉑(cisplatin)對黑素瘤B16-BL6細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長的抑制作用［12］。因此，芹菜素不但自身具備抗腫瘤活性，并且與抗癌藥物聯(lián)用也表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效果。

肺癌作為癌癥最多發(fā)的形式，是世界范圍內(nèi)引起癌癥死亡最主要的病因之一［20］。肺癌的高致死率，一方面是由于缺乏有效的早期檢測手段，另一方面是腫瘤對許多治療處理產(chǎn)生了抗性［10］。芹菜素已被發(fā)現(xiàn)可以抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖以及在裸鼠中抑制其腫瘤生長和血管生成;并且，芹菜素可以通過半胱天冬酶和線粒體依賴通路(caspase-and mitochondria-dependent pathways)來誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌 A549 和 H460 的細(xì)胞凋亡［10，21-22］。本研究首次證明芹菜素可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性。這將對在非小細(xì)胞肺癌中提高抗腫瘤藥物的治療效果以及藥物的聯(lián)合治療起到一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM購自GIBCO，胰蛋白酶購自上海生工，新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，抗生素antibioticantimycotic購自GIBCO。四甲基偶氮唑鹽［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt;MTS］和吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)購自 Promega，二甲基亞砜(DMSO)、芹菜素 (apigenin)、博來霉素(bleomycin)和奧沙利鉑(oxaliplatin)購自Sigma。芹菜素用DMSO配制成50 mmol/L，博來霉素用DMSO配制成20 mmol/L，奧沙利鉑用5%葡萄糖配制成12.5 mmol/L，均于-20℃避光貯存。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株A549、H460、LTEP-a2和 NCI-H292均購自上海生命科學(xué)研究院，細(xì)胞在含15%新生牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時，取對數(shù)生長期細(xì)胞，按所需細(xì)胞數(shù)量種板，細(xì)胞貼壁后加藥處理。

1.2 方法

1.2.1 臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計數(shù) 取對數(shù)生長期肺癌細(xì)胞，分別按1×104個/孔種24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，過夜貼壁后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入含選定濃度(A549細(xì)胞用10 μmol/L和 20 μmol/L 2個濃度，其它細(xì)胞分別用30 μmol/L和50 μmol/L 2個濃度)芹菜素的 DMEM(含1%抗生素)培養(yǎng)基500 μl，根據(jù)孵育時間分3組:24 h、48 h和72 h組，每組3個復(fù)孔;到規(guī)定的孵育時間后，棄去培養(yǎng)基，每孔用150 μl胰酶消化，并用等體積的培養(yǎng)基終止，吹成均勻細(xì)胞懸液;然后，取部分懸液臺盼藍(lán)染色，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計算活細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 MTS法檢測抗癌藥物的抗細(xì)胞增殖作用 取對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞，按1×104個/孔種96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁后棄去培養(yǎng)基，試驗(yàn)組每孔加入不同濃度(A549細(xì)胞中10 μmol/L，H460 細(xì)胞中50 μmol/L，LTEP-a2 細(xì)胞中30 μmol/L，H292 細(xì)胞中20 μmol/L)芹菜素的DMEM(含1%抗生素)培養(yǎng)基 200 μl，并設(shè)不加藥空白和加DMSO的對照組，過夜處理后，棄去培養(yǎng)基，用1×PBS洗1遍。然后，用含1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基稀釋配制不同濃度的博來霉素和奧沙利鉑，設(shè)不加藥空白對照組和DMSO對照組，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，每孔200 μl藥液處理，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h終止，加入MTS/PMS混合液(DPBS∶MTS∶PMS=10∶10∶1)40 μl/孔，再于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5～1 h后，用全波長酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測OD值。

其中，D代表濃度，Dm代表半數(shù)抑制濃度，fa代表抑制率;

其中，(D)1和(D)2分別代表兩種藥物聯(lián)用時各自的濃度，x代表其聯(lián)用產(chǎn)生的抑制率。(Dx)1和(Dx)2則表示達(dá)到聯(lián)用相同抑制效果所需的其中任何一種藥物的濃度，需要分別由公式(1)進(jìn)行計算得出。CI=1代表積和作用，CI＜1代表協(xié)同作用，CI＞1代表拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用 4種肺癌細(xì)胞分別選用2個濃度的芹菜素孵育24 h、48 h和72 h，然后用血小板計數(shù)器分別計算芹菜素處理后的細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果表明，芹菜素能抑制4種肺癌細(xì)胞的增殖(圖1)，并且這種增殖抑制作用呈一定的劑量效應(yīng)。在24 h、48 h和72 h 3個時間點(diǎn)，10 μmol/L的芹菜素使A549細(xì)胞的增殖分別被抑制到對照組的77%、45%和82%;而30 μmol/L的芹菜素，使H460細(xì)胞的增殖分別被抑制到對照組的81%、85%和37%，使LTEP-a2細(xì)胞的增殖分別被抑制到對照組的48%、65%和66%，使H292細(xì)胞的增殖分別被抑制到對照組的44%、49%和63%。

2.2 芹菜素增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性 為避免芹菜素自身毒性過大，干擾增敏實(shí)驗(yàn)，本研究在 A549、H460、LTEP-a2和 H292細(xì)胞聯(lián)合用藥的芹菜素濃度分別選定為10 μmol/L、50 μmol/L、30 μmol/L 和 20 μmol/L(圖2A、B)。經(jīng)公式(1)和公式(2)分別計算出奧沙利鉑和博來霉素在上述4種肺癌細(xì)胞聯(lián)用前后的IC50值(圖2)，以及芹菜素分別與奧沙利鉑和博來霉素聯(lián)用時每個濃度點(diǎn)的CI值(表1和表2)。圖2C-F示芹菜素能增加抗癌藥物奧沙利鉑和博來霉素的毒性，芹菜素過夜預(yù)處理使得每實(shí)驗(yàn)組抗癌藥物的IC50值都顯著下降。在A549細(xì)胞中，博來霉素的IC50值由94.91 μmol/L 降至 12.46 μmol/L，奧沙利鉑的IC50值由115.87 μmol/L 降至 60.59 μmol/L;在H460細(xì)胞中，博來霉素的 IC50值由250.36 μmol/L 降至 14.71 μmol/L，奧沙利鉑的 IC50值由1 177.91 μmol/L 降 至 27.55 μmol/L;在LTEP-a2細(xì)胞中，博來霉素的IC50值由1 075.30 μmol/L 降至140.09 μmol/L，奧沙利鉑的 IC50值由22.54 μmol/L 降至 5.11 μmol/L;在 H292 細(xì)胞中，博來霉素的IC50值由144.95 μmol/L降至57.43 μmol/L，奧 沙 利鉑的 IC50值 由 95.60 μmol/L降至55.86 μmol/L。再者，每個實(shí)驗(yàn)組中的芹菜素與抗癌藥物在每個濃度處的聯(lián)合作用指數(shù)(CI值)絕大多數(shù)都小于1(表1、表2)。這提示芹菜素能很好地增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性，與抗癌藥物有協(xié)同作用。

圖1 芹菜素抑制肺癌細(xì)胞的增殖Fig.1 The proliferation of lung cancer cells suppressed by apigenin

表1 芹菜素在肺癌細(xì)胞中與奧沙利鉑聯(lián)用的CI值Table 1 Analysis of combined treatment of apigenin with oxaliplatin in lung cancer cells combination index

圖2 芹菜素對4種肺癌細(xì)胞的毒性以及增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性Fig.2 The increased susceptibility oflung cancercellsby apigenin to antitumor drugs

3 討論

Abate等人發(fā)現(xiàn)芹菜素在鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中可以抑制氯化血紅素(hemin)誘導(dǎo)的 HO-1蛋白水平和mRNA 表達(dá)［25］，而 Kim 等指出，在肺癌細(xì)胞中，Nrf2-HO-1信號通路與癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥性密切相關(guān)，利用HO-1小干擾RNA或ZnPPIX抑制HO-1的表達(dá)，可增強(qiáng)A549細(xì)胞對順鉑的敏感性［26］。除HO-1外，其它由Nrf2信號通路調(diào)控的下游基因，如Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶及藥物流出泵等的表達(dá)也與腫瘤耐藥性相關(guān)［27］。另外，Nrf2 信號通路也被證明可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平［28］，而細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽平衡及谷胱甘肽依賴的酶在腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物的耐藥性方面起關(guān)鍵作用［29］。最近，辛愛等通過在人肺癌H460細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Nrf2-shRNA建立的Nrf2降表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，與對照組相比，谷胱甘肽水平顯著減低，奧沙利鉑的細(xì)胞毒性顯著增加［30］。而之前，Kachadourian等報道，在A549細(xì)胞和人類前列腺癌PC-3細(xì)胞中，芹菜素可以顯著降低谷胱甘肽水平［31］，因此，我們推測芹菜素很有可能通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽水平來增敏肺癌細(xì)胞，而且此過程可能與 Nrf2信號通路有關(guān)。

總之，本研究證實(shí)了芹菜素在肺癌細(xì)胞中具有廣泛的抗增殖作用，尤其是可以增敏肺癌細(xì)胞，提高抗癌藥物的效果。這提示芹菜素將在今后的肺癌臨床治療中具有廣闊的前景，其在體內(nèi)應(yīng)用的安全性及毒副反應(yīng)有待進(jìn)一步的研究。

表2 芹菜素在肺癌細(xì)胞中與博來霉素聯(lián)用的CI值Table 2 Analysis of combined treatment of apigenin with bleomycin in lung cancer cells:combination index

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