盛立霞，謝曉寶，歐陽桂芳，王 怡，朱慧玲，黃 河

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，浙江杭州310003;2.寧波市第一醫(yī)院血液科，浙江寧波315010;3.蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液科，江蘇常州213003)

多藥耐藥基因1(multidrug resistance gene1，MDR1)及其編碼的膜表面P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)高表達(dá)是介導(dǎo)白血病細(xì)胞對常規(guī)化療耐藥的重要機(jī)制之一，傳統(tǒng)化療后殘留的耐藥細(xì)胞往往是白血病復(fù)發(fā)的根源。在動物實驗及初步臨床結(jié)果中，基于樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的免疫治療能清除微小殘留病灶，為預(yù)防白血病復(fù)發(fā)提供了新的治療策略［1］。在我們的前期工作中已經(jīng)證實，耐藥細(xì)胞所表達(dá)的Pgp能夠作為免疫識別的靶抗原，通過負(fù)載DC誘導(dǎo)Pgp特異性的免疫應(yīng)答，從而殺傷殘留的耐藥白血病細(xì)胞［2］。轉(zhuǎn)染MDR1基因無疑是一種有效負(fù)載Pgp抗原的方案，但是，將MDR1基因轉(zhuǎn)染DC前體細(xì)胞是否影響DC的誘導(dǎo)分化效率，高表達(dá)Pgp是否影響DC的抗原遞呈功能，分化的DC能否獲得多藥耐藥特征?這些問題都迫切需要進(jìn)一步的研究。為此，本研究采用細(xì)胞因子組合，分別誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染MDR1基因的耐藥K562細(xì)胞株及親本K562細(xì)胞株分化為樹突狀細(xì)胞，探討MDR1基因轉(zhuǎn)染DC前體細(xì)胞對誘導(dǎo)分化后DC的表型及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 RPMI 1640、胎牛血清(FBS)為 GIBCO 公司生產(chǎn);rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α購自Peprotech公司;MTT為Sigma公司產(chǎn)品;FITC或PE標(biāo)記鼠抗人 CD1α、CD83、CD80、CD86、HLA-ABC、HLA-DR 和 Pgp 等單抗及同型對照購自 BD公司，流式細(xì)胞儀為FACScabilur型，BD公司生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞株與培養(yǎng)條件 K562和K562/MDR1細(xì)胞株由江蘇省血液病研究所陳子興教授惠贈。其中，K562/MDR1細(xì)胞是由逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法將外源MDR1基因轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞，并經(jīng)過長春新堿(VCR)篩選獲得的多藥耐藥細(xì)胞株，傳20代后仍穩(wěn)定高表達(dá)Pgp糖蛋白，具有經(jīng)典MDR1表型及多藥耐藥特征［3］。K562和K562/MDR1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640中。本實驗均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 K562和K562/MDR1來源DC誘導(dǎo)培養(yǎng)

取對數(shù)生長期的K562和K562/MDR1細(xì)胞，用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，并接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔 1 ml，加入 rhGM-CSF(1 000 IU/ml)、rhIL-4(800 IU/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日半量換液并補(bǔ)上述細(xì)胞因子;培養(yǎng)至第10天加入 rhTNF-α(100 IU/ml)，共培養(yǎng)14 d。在培養(yǎng)過程中動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)及進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測DC的表型以及Pgp表達(dá) 收集培養(yǎng)14 d的細(xì)胞，采用直接免疫熒光染色法，加入PE或FITC標(biāo)記的鼠抗人CD1α、CD83、CD14、CD80、CD86、HLA-ABC、HLA-DR以及Pgp等單抗或同型陰性對照鼠IgG1孵育30 min，PBS洗滌2遍后加入PBS 400 μl上機(jī)，采用FACScabilur型流式細(xì)胞儀CELLQUEST軟件檢測分析。

1.5 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(allo-MLR) 取健康供者外周血10 ml，肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法獲得PBMC，將PBMC用10%FBSRPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整為2×106/ml接種于24孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育 2 h，收集非黏附細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞(R);培養(yǎng)14 d的K562-DC、K562/MDR1-DC 用 25 μg/ml絲裂霉素處理30 min去增殖作為刺激細(xì)胞(S)。將S∶R 分別按1∶5、1∶10、1∶20 加入 96 孔板，各 200 μl/孔，每組3個復(fù)孔;另設(shè)刺激細(xì)胞、反應(yīng)細(xì)胞對照孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育96 h。采用MTT比色法測570 nm波長處的吸光度(A值)，刺激指數(shù)(SI)=(A實驗孔-A刺激細(xì)胞孔)/A反應(yīng)細(xì)胞孔。

1.6 MTT方法測定藥物IC50值 收集對數(shù)生長期的 K562、K562/MDR1以及培養(yǎng)14 d的K562-DC、K562/MDR1-DC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/ml，在96孔板的各孔中加入100 μl細(xì)胞和不同質(zhì)量濃度藥物:阿霉素(ADM)0～100.0 μg/ml或者長春新堿(VCR)0 ～100.0 μg/ml，各濃度設(shè)3個平行孔，設(shè)對照孔和空白孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h，采用MTT比色法測570 nm波長處的 A值。生長抑制率(%)=A實驗組/A對照組×100%，計算出細(xì)胞生長抑制率50%的藥物濃度即IC50，耐藥倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50。

1.7 細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素(DNR)蓄積量的測定將上述4種細(xì)胞按1×106/ml的質(zhì)量濃度與1 μg/ml的 DNR 37℃共同孵育2 h后，冰浴終止。參照文獻(xiàn)［4］方法用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)DNR的蓄積量，以未經(jīng)處理的K562/MDR1細(xì)胞為空白對照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計分析均由SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計軟件完成，統(tǒng)計方法采用SPSS中一般線性模型進(jìn)行雙因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 K562/MDR1-DC的形態(tài)及表型特征K562及K562-MDR1細(xì)胞在含GM-CSF+IL-4的培養(yǎng)體系誘導(dǎo)下，3～4 d后體積逐步增大，形態(tài)由圓形轉(zhuǎn)為不規(guī)則，7 d后不規(guī)則細(xì)胞增多，體積進(jìn)一步變大，部分細(xì)胞可見樹突狀突起，加入TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)至14 d時，細(xì)胞樹狀突起明顯，數(shù)量也進(jìn)一步增多，具有典型的DC形態(tài)特征。

K562/MDR1-DC和K562-DC細(xì)胞的CDla、CD83、CD80、CD86、HLA-DR 在細(xì)胞因子的作用下，表達(dá)較誘導(dǎo)前均有明顯的上調(diào)。經(jīng)雙因素方差分析顯示，誘導(dǎo)分化過程對DC相關(guān)表型的上調(diào)具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而轉(zhuǎn)染MDR1基因?qū)C表型無顯著影響(P＞0.05)，兩者之間無交互效應(yīng)(P＞0.05)，K562/MDR1-DC細(xì)胞和K562-DC細(xì)胞之間的各DC相關(guān)表型的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，這表明轉(zhuǎn)染MDR1基因并不影響K562細(xì)胞誘生DC的免疫表型(表1)。

2.2 K562/MDR1-DC的抗原遞呈功能 通過MTT法測得各組細(xì)胞對異基因淋巴細(xì)胞的刺激增殖能力(表2)。誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d所獲得的K562/MDR1-DC、K562-DC均能夠刺激異體淋巴細(xì)胞增殖，其SI明顯高于誘導(dǎo)前的K562、K562/MDR1細(xì)胞(P＜0.001);且隨著S∶R比值增加，其刺激增殖的能力亦增強(qiáng)(P＜0.001)。在相同S∶R比值下，K562/MDR1-DC組的SI高于K562-DC組(P＜0.01);但是，兩組之間的DC表型并無統(tǒng)計學(xué)差異(表1)，這提示高表達(dá)Pgp能增強(qiáng)DC的抗原遞呈能力。

2.3 K562/MDR1-DC的Pgp表達(dá)及藥物外排功能 流式細(xì)胞儀分析提示Pgp表達(dá)在K562細(xì)胞誘導(dǎo)前后有輕度變化，陽性比例從(0.93±0.52)%上調(diào)至(2.35±0.83)%(P＜0.05);而在K562/MDR1向DC的誘導(dǎo)分化過程中，Pgp表達(dá)則有輕度下調(diào)，從(97.18±1.61)%降至(92.72±3.64)%(P＜0.05);分化后的K562/MDR1-DC的Pgp表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于K562-DC(P＜0.01，圖1)。為觀察細(xì)胞中Pgp介導(dǎo)的對DNR的外排作用，將各組細(xì)胞與1 μg/ml的DNR孵育2 h后，通過FCM檢測DNR的自發(fā)熒光。圖1B示，K562/MDR1及K562/MDR1-DC組的熒光強(qiáng)度(MFI)輕度低于敏感細(xì)胞株K562組及其誘生的K562-DC組，提示Pgp在誘導(dǎo)DC分化過程中能夠繼續(xù)穩(wěn)定表達(dá)并且介導(dǎo)對化療藥物的外排作用(圖2)。

表1 K562及K562/MDR1誘導(dǎo)DC前后的表型變化Table 1 The phenotypic changes during differentiation of K562 and K562/MDR1 cells into DC(%，±s)

表1 K562及K562/MDR1誘導(dǎo)DC前后的表型變化Table 1 The phenotypic changes during differentiation of K562 and K562/MDR1 cells into DC(%，±s)

與K562組比較，*P＜0.001;與K562-MDR1組比較，#P＜0.001;K562-DC組與K562/MDR1-DC組的各表型比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義.

組 別 CD1αCD83 CD80 CD86 HLA-DR HLA-ABC誘導(dǎo)前的前體細(xì)胞K562 1.15±0.82 0.84±0.52 0.48±0.33 0.75±0.26 1.67±0.82 0.87±0.49 K562/MDR1 1.71±0.68 0.90±0.73 1.03±0.82 0.55±0.42 1.31±0.63 1.01±0.52誘導(dǎo)分化后的DC K562-DC 21.24±8.12*# 37.21±6.04*# 43.52±3.95*# 23.18±3.09*# 35.61±2.32*#37.26±2.34*#K562/MDR1-DC 19.31±5.76*# 43.36±4.24*# 40.11±2.75*# 27.24±5.36*# 38.06±5.03*#38.15±2.07*#

表2 K562-DC與K562/MDR1-DC刺激異基因淋巴細(xì)胞增殖的能力比較Table 2 Proliferation of allogenetic lymphocytes stimulated by K562-DC and K562/MDR1-DC

圖1 K562和K562/MDR向DC分化前后的Pgp表達(dá)Fig.1 The expression of Pgp before and after differentiation of K562 and K562/MDR1 cells into DC

2.4 K562/MDR1-DC的耐藥特征 在誘導(dǎo)分化前，轉(zhuǎn)染 MDR1基因使 K562對 VCR、ADM的IC50分別提高101、235倍;在細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化后，K562/MDR1-DC仍保持對 VCR、ADM的耐藥特征，其IC50分別是(366.92±35.88)μg/ml及(28.43 ±6.32)μg/ml，但較誘導(dǎo)前下降(P＜0.05)。K562-DC對兩種藥物的IC50分別為(6.15±2.29)μg/ml及(0.42±0.26)μg/ml，較誘導(dǎo)前有所升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。以 K562/MDR1-DC與K562-DC的 IC50比值計算耐藥倍數(shù)，對VCR、ADM的耐藥倍數(shù)分別為60、68倍，較誘導(dǎo)分化前有所下降(表3)。

圖2 K562、K562/MDR向DC分化前后DNR外排功能Fig.2 The efflux of DNR before and after differentiation of K562 and K562/MDR1 cells into DC

表3 K562/MDR1與K562細(xì)胞在向DC分化前后對ADM和VCR的藥敏試驗Table 3 The sensitivity of K562/MDR1-DC and K562-DC cells to vincristine and adriamycin

3 討論

由MDR1基因編碼的分子量為170 kD的膜糖蛋白Pgp的過度表達(dá)是介導(dǎo)白血病多藥耐藥的經(jīng)典機(jī)制［5］。Pgp的高表達(dá)往往與白血病的化療耐藥及不良預(yù)后密切相關(guān)。一些Pgp的拮抗劑如維拉帕米、環(huán)抱素A可通過競爭底物來逆轉(zhuǎn)MDR1，然而真正能取得滿意臨床療效的甚少。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，將表達(dá)Pgp的耐藥白血病細(xì)胞與DC融合可以誘導(dǎo)針對Pgp的特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，這表明Pgp蛋白作為耐藥細(xì)胞表面標(biāo)記的同時還可以作為白血病免疫治療的靶分子，誘導(dǎo)針對耐藥白血病的免疫應(yīng)答。為此，我們提出如下設(shè)想:如果將外源MDR1基因?qū)隓C前體細(xì)胞，那么誘生的DC將高表達(dá)Pgp。其一方面可以誘生出Pgp特異的CTL應(yīng)答，特異殺傷耐藥細(xì)胞;另一方面有可能使得DC獲得對多種化療藥物的抗性，這對化療后的免疫重建，以及免疫治療與化療雙聯(lián)應(yīng)用成為可能。

為了驗證這一設(shè)想的可行性，我們首先檢測轉(zhuǎn)染MDR1進(jìn)入DC前體細(xì)胞是否影響其向DC分化的能力。采用慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞作為DC分化的細(xì)胞模型。K562具有向巨核、紅系、單核細(xì)胞系多系分化的潛能，在PMA或者細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)下，能夠向DC樣細(xì)胞分化，上調(diào)DC相關(guān)的表面標(biāo)記，顯示對同種異體淋巴細(xì)胞的刺激增殖能力，因而K562細(xì)胞可以作為DC分化研究的細(xì)胞模型［6-7］。通過 MDR1基因轉(zhuǎn)染 DC前體細(xì)胞K562，發(fā)現(xiàn)與親代 K562類似，K562/MDR1在細(xì)胞因子組合作用下能夠分化為白血病來源的DC，上調(diào) DC相關(guān)的表面標(biāo)志，如 CD1a和CD83以及HLA-Ⅰ、Ⅱ類抗原，協(xié)同刺激分子CD80和CD86等的表達(dá)。這些標(biāo)記的表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染的K562誘導(dǎo)組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，證明轉(zhuǎn)染MDR1基因并不影響K562細(xì)胞向DC的分化。

在此細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，我們還證實了MDR1基因在細(xì)胞因子誘導(dǎo)前后能夠穩(wěn)定表達(dá)并且傳遞多藥耐藥特性。過度表達(dá)的MDR1基因及Pgp蛋白對DC本身功能的影響尚無明確報道。在生理情況下，Pgp作為一種跨膜轉(zhuǎn)運泵，功能性表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，可能通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)可溶性底物的跨膜運轉(zhuǎn)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，在DC的遷移、抗原遞呈過程中發(fā)揮重要作用［8-9］。Schroeijers等［10］發(fā)現(xiàn)，在人 DC 前體細(xì)胞向DC分化過程中，Pgp蛋白的表達(dá)輕度上調(diào)。Lee等［11］報道，Pgp在小鼠骨髓來源的DC的分化發(fā)育過程中起著重要作用，并且在DC的分化成熟過程中MDR-1基因和Pgp蛋白上調(diào);通過文拉法辛下調(diào)Pgp的表達(dá)則可抑制DC的分化和成熟過程中細(xì)胞因子IL-1、IL-10及IL-12的產(chǎn)量。本研究結(jié)果也顯示，K562細(xì)胞在向DC分化過程中Pgp表達(dá)有輕度上調(diào)。但是，K562/MDR1分化為DC后Pgp的表達(dá)反而輕度下調(diào)，這可能是由于外源轉(zhuǎn)染的MDR1基因的表達(dá)與生理條件下的調(diào)節(jié)機(jī)制不同有關(guān)。在DC相關(guān)表型無顯著差異的情況下，高表達(dá)Pgp的K562/MDR1-DC較K562-DC在Allo-MLR中顯示更強(qiáng)的抗原遞呈功能，提示Pgp高表達(dá)可能有利于增強(qiáng)DC的抗原遞呈功能。與Pgp的高水平表達(dá)一致，分化后的K562/MDR1-DC仍保持多藥耐藥特性，對DNR的外排增加，對ADM及VCR的IC50明顯高于敏感細(xì)胞株誘導(dǎo)的K562-DC。

DC作為功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，能有效遞呈白血病抗原，啟動特異抗白血病的T細(xì)胞應(yīng)答。DC疫苗結(jié)合傳統(tǒng)化療的治療模式已成為清除微小殘留病變和防止白血病復(fù)發(fā)的希望所在。但是化療后常導(dǎo)致DC等免疫細(xì)胞的清除及功能受損，必然消減了DC疫苗的療效。因而，通過轉(zhuǎn)染MDR1基因獲得高表達(dá)Pgp的具有多藥耐藥特征的DC具有重要意義。①Pgp參與DC的遷移、抗原加工及遞呈、自分泌及旁分泌等多種生理功能，高表達(dá)后可能更有利于DC抗原遞呈功能的執(zhí)行;②高表達(dá)Pgp可以使得DC獲得多藥耐藥特征，從而抵抗化療藥物對其清除作用，在免疫應(yīng)答始動環(huán)節(jié)發(fā)揮免疫監(jiān)視作用，有利于化療后的免疫重建及監(jiān)視，并且使得免疫治療與化療可以同時進(jìn)行;③Pgp蛋白具有免疫原性，可被DC有效遞呈，誘導(dǎo)針對Pgp的特異性CTL應(yīng)答，從而為白血病多藥耐藥的免疫治療提供新靶點。

本研究中以白血病細(xì)胞株為模型可能不能完全代表正常的DC分化過程，尚需進(jìn)一步開展在正常DC前體細(xì)胞，如CD14+單核細(xì)胞及CD34+造血干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MDR1基因的研究。

［1］DAVISON G M.Dendritic cells，T-cells and their possible role in the treatment of leukaemia and lymphoma ［J］.Transfus Apher Sci，2010，42:189-192.

［2］SHENG Li-xia，OU-YANG Gui-fang，XIE Xiao-bao，et al.(盛立霞，歐陽桂芳，謝曉寶，等)Induction of P170 glycoprotein-specific CTL responses by fusion of dendritic cell with K562/MDR cell［J］.Chinese Journal of Hematology(中華血液學(xué)雜志)，2006，27(12):821-824.(in Chinese)

［3］FU Jian-xin，CEN Jian-nong，WANG Wei，et al(傅建新，岑建農(nóng)，王 瑋，等).Reversal of multidrug resistance in leukemic cell line K562/MDR ［J］.Chinese Journal of Hematology(中華血液學(xué)雜志)，1999，20:154-155.(in Chinese)

［4］CHENG J，WU W，CHEN B A，et al.Effect of magnetic nanoparticles of Fe3O4and 5-bromotetrandrine on reversal of multidrug resistance in K562/A02 leukemic cells ［J］.Int J Nanomedicine，2009，4:209-216.

［5］HIROSE M，HOSOI E，HAMANO S，JALILI A.Multidrug resistance in hematological malignancy［J］.J Med Invest，2003，50:126-135.

［6］LINDNER I，KHARFAN-DABAJA M A，AYALA E，et al.Induced dendritic cell differentiation of chronic myeloid leukemia blasts is associated with down-regulation of BCR-ABL ［J］.J Immunol，2003，171:1780-1791.

［7］KHARFAN-DABAJA M，AYALA E，LINDNER I，et al.Differentiation of acute and chronic myeloid leukemic blasts into the dendritic cell lineage:analysis of various differentiation-inducing signals［J］.Cancer Immunol Immunother，2005，54:25-36.

［8］VAN DE VEN R，OERLEMANS R，VAN DER HEIJDEN J W，et al.ABC drug transporters and immunity:novel therapeutic targets in autoimmunity and cancer［J］.J Leukoc Biol，2009，86:1075-1087.

［9］VAN DE VEN R，SCHEFFER G L，SCHEPER R J，et al.The ABC of dendritic cell development and function ［J］.Trends Immunol，2009，30:421-429.

［10］SCHROEIJERS A B，REURS A W，SCHEFFER G L，et al.Up-regulation of drug resistance-related vaults during dendritic cell development［J］.J Immunol，2002，168:1572-1578.

［11］LEE J S，JUNG I D，LEE C M，et al.Venlafaxine inhibits the development and differentiation of dendritic cells through the regulation ofpglycoprotein ［J］.Int Immunopharmacol，2011(Epub ahead of print).