趙妍敏，吳康妮，王穎佳，吳功強，曹偉杰，于曉紅，黃 河

(浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，Akt/mTOR)信號通路調節(jié)異常與白血病等多種腫瘤形成、細胞惡性轉化相關。Akt/mTOR在大部分急性髓系白血病細胞中存在組成性活化，mTOR上游蛋白Akt和下游蛋白4E-BP1、S6K均處于持續(xù)磷酸化狀態(tài)。在慢性粒細胞白血病和急性淋巴細胞白血病細胞中也證實了mTOR信號通路的過度激活。mTOR信號轉導通路的異常激活不僅參與白血病細胞的增殖、存活、代謝、細胞周期調控和葡萄糖轉運等過程，而且可能與白血病對化療藥物的耐藥相關。

急性T淋巴細胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)是一種惡性程度高、預后差的淋巴系統(tǒng)惡性克隆性疾病。近年來隨著大劑量聯合化療方案的應用，T-ALL的預后有了較大改善，但仍有部分T-ALL患者對標準治療耐藥，出現難治或復發(fā)。蒽環(huán)類藥物是治療T-ALL誘導緩解方案的常用藥物，對蒽環(huán)類藥物信號通路的研究發(fā)現，其在引起細胞凋亡的同時，可激活Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK等的信號通路，因而容易產生耐藥［1-4］。

聯合新型分子靶向治療能克服化療耐藥、提高療效，是近年來研究的熱點。我們前期研究表明，mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin，Rapa)在T-ALL細胞中能有效地抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，并呈時間、濃度依賴地抑制細胞生長［5］。基于這些理論，我們擬研究雷帕霉素聯用蒽環(huán)類代表藥物去甲氧柔紅霉素(idarubicin，IDA)治療T-ALL的可能性，是否有助于克服T-ALL的耐藥及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 急性T淋巴細胞白血病細胞株Jurkat由中科院上海細胞所引進。

1.2 主要試劑 雷帕霉素購于Sigma公司，以DMSO溶解，配成濃度為1 mmol/L貯存液，分裝后-20℃貯存。IDA由輝瑞公司惠贈，以PBS溶解，配成濃度為5 μmol/L的貯存液，分裝后-20℃貯存。貯存液于臨用前再稀釋至合適濃度，本實驗DMSO終濃度不超過0.5%。CCK-8購于日本Dojindo公司。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購于美國BD-Pharmingin公司。Caspase3、Caspase9、Caspase8、PARP、Akt、p-Akt、P70S6K、p-P70S6K、ERK 和 p-ERK 抗體購于美國Cell Signaling Technology公司;Actin和GAPDH抗體購于Santa Cruz公司;辣根標記山羊抗兔、山羊抗鼠IgG(H+L)購于北京中山生物技術公司。

1.3 細胞培養(yǎng) Jurkat細胞采用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液傳代1次。取對數生長期細胞為實驗對象。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖 選擇對數生長期Jurkat細胞，接種于96孔板，各孔總體積200 μl，含有4×104個細胞，分別加入不同終濃度(0、1、2.5、5、10、25 和 50 nmol/L)的 IDA 或不同終濃度的IDA聯合10 nmol/L雷帕霉素，培養(yǎng)24 h，同時設定對照組，每組設4個復孔。到達時點后，加入CCK-8 10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標儀450/630 nmol/L雙波長測定吸光度A值。按以下公式計算細胞生長抑制率:細胞生長抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%，并計算半數抑制濃度(50%inhibition concentration，IC50)劑量。

1.5 Isobologram法分析兩藥聯合作用的性質

將單用雷帕霉素或IDA的IC50為橫縱坐標末端點，以直線相連;將聯用雷帕霉素和IDA使細胞生長抑制率為50%的不同劑量為橫縱坐標描點。若聯合用藥點在直線之下表示聯合指數(combination index，CI)小于1，兩藥聯合有協同作用;在直線上表示聯合指數等于1，兩藥聯合有相加作用;在直線之上表明聯合指數大于1，兩藥聯合有拮抗作用［6］。

1.6 透射電鏡形態(tài)學觀察 收集細胞，以PBS洗滌2次，1 000 r/min離心，沿管壁逐滴加入3%戊二醛固定，包埋切片后，定位觀察并照相。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 參照Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。細胞以5×105/ml接種于6孔培養(yǎng)板，并以單藥及聯合用藥處理細胞。選取單藥24 h生長抑制率小于20%的濃度，因此選取IDA 5 nmol/L、雷帕霉素10 nmol/L濃度處理細胞。同時，設DMSO對照組，24 h后收獲細胞。收集1×106個細胞，冷 PBS洗滌2次，1 000 r/min離心，4℃ 7 min，棄上清。將細胞重懸于1 ml 1×Binding buffer，取 100 μl細胞置于流式細胞儀專用試管中，加 5 μl Annexin V FITC 和 5 μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應15 min，加入300 μl 1×Binding buffer，立即用流式細胞儀檢測，Cellquest 1.2分析軟件分析結果。

1.8 免疫印跡實驗 藥物處理劑量同上。即收集經IDA 5 nmol/L、雷帕霉素10 nmol/L、IDA 5 nmol/L聯合雷帕霉素10 nmol/L處理24 h細胞及對照組細胞，提取總蛋白，采用Brad-ford法檢測蛋白濃度。將50 g蛋白經10% ～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，轉移至PVDF膜，于搖床上封閉2 h，然后分別加入單克隆抗 Caspase3、PARP、Caspase8、Caspase9、Akt、pAkt、P85S6K、p-P85S6K 、P70S6K、p-P70S6K、ERK、p-ERK 一抗，4 C過夜，TBS/T充分漂洗。加入辣根過氧化物酶連接的二抗，室溫孵育1.5 h，同上漂洗，與ECL化學發(fā)光試劑反應1 min，常規(guī)方法顯影、定影。以Quality One軟件計算蛋白產物條帶的相對光密度值。

1.9 統(tǒng)計分析方法 采用SPSS 12統(tǒng)計處理軟件分析，計量資料實驗數據以均數±標準差(±s)表示。多組資料均數之間的比較采用One way ANOVA，兩兩比較采用 SNK-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雷帕霉素聯合IDA對Jurkat細胞株的增殖抑制作用 CCK8法檢測發(fā)現IDA作用Jurkat細胞24 h的IC50為21.8 nmol/L，雷帕霉素作用Jurkat細胞24 h的IC50為344 nmol/L，聯合10 nmol/L的雷帕霉素能使IDA的IC50降至 2.95 nmol/L。單用 1 nmol/L、2.5 nmol/L、5 nmol/L的IDA作用Jurkat細胞24 h的增殖抑制率分別為(4.06±4.3)%、(4.25±1.48)%、(19.72±13.06)%，而與10 nmol/L雷帕霉素聯用后，增殖抑制率分別增加為(36.73±10.19)%、(38±11.08)%、(55.37±16.3)%(圖1-A)。

按Isobologram方法［6］得出兩藥的聯合指數小于1，說明兩藥對Jurkat細胞株的增殖抑制具有協同效應(圖1-B)。

圖1 IDA單用及聯用雷帕霉素作用Jurkat細胞24 h的生長抑制作用Fig.1 Inhibition rate of Jurkat cell viability exposed to IDA or IDA+rapamycin for 24 hours

2.2 雷帕霉素增強IDA對Jurkat細胞株的誘導凋亡作用

2.2.1 形態(tài)學觀察 光鏡下觀察未經處理的Jurkat細胞呈現圓形或橢圓形，大小均一，部分成團生長，折光度強;經低濃度IDA處理的細胞形態(tài)上無明顯差異，少部分出現體積減小;經10 nmol/L雷帕霉素聯合低濃度IDA處理24 h的細胞出現明顯的空泡化、體積縮小變形，折光度降低，并有較多的細胞碎片。采用電鏡進一步觀察，發(fā)現未經處理和單用低濃度IDA處理的細胞體積均較大，核仁明顯，染色質疏松;經IDA和雷帕霉素聯用處理后體積變小，胞核固縮不規(guī)則，染色質濃縮邊集，胞核成半月形(圖2)。

圖2 IDA單用及聯用雷帕霉素作用Jurkat細胞24 h的電鏡觀察Fig.2 Morphological changes of Jurkat cells exposed to IDA or IDA+rapamycin for 24 hours under electron microscope

2.2.2 PS轉位分析 Annexin VFITC和PI雙標記細胞后經流式細胞儀檢測結果顯示，10 nmol/L雷帕霉素、5 nmol/L IDA及5 nmol/L IDA+10 nmol/L雷帕霉素作用于Jurkat細胞24 h，凋亡細胞百分數分別為(7.21±2.63)%、(17.51±3.20)%、(50.17±5.19)%，與空白對照組(6.78±2.17)%相比，IDA組及IDA+雷帕霉素組的凋亡細胞百分數均有升高(P＜0.01)，而IDA+雷帕霉素組較IDA組的凋亡細胞百分數顯著升高(P＜0.01，圖3)。說明雷帕霉素單藥雖不能引起Jurkat細胞發(fā)生明顯的凋亡，但可增強IDA誘導凋亡的作用。

圖3 IDA單用及聯用雷帕霉素作用Jurkat細胞24 h的凋亡比例Fig.3 Apoptosis in Jurkat cells after treatment of IDA and/or rapamycin for 24 hours using Annexin V/PI staining method

2.3 Caspase3、8、9及 PARP活性的分析 分別以 10 nmol/L雷帕霉素、5 nmol/L IDA、5 nmol/L IDA+10 nmol/L雷帕霉素處理Jurkat細胞24 h，經Western blot檢測可見IDA單用組Caspase3、Caspase9、PARP激活帶不明顯，Caspase8激活帶較弱，而聯用組出現明顯的Caspase3、8、9 和 PARP 激活帶(圖4)。

2.4 雷帕霉素聯合IDA對Jurkat細胞株的Akt/mTOR、ERK信號通路的影響 本實驗在Jurkat細胞株中檢測了IDA對Akt/mTOR、ERK信號通路的活化狀態(tài)的影響。結果發(fā)現5 nmol/L IDA明顯促進Jurkat細胞S6K的磷酸化，且增強Akt的磷酸化，明確了IDA對Akt/mTOR信號通路活化的作用，而聯用10nmol/L雷帕霉素能使Jurkat細胞株P70S6K和Akt磷酸化水平明顯降低。此外，單用5nmol/L IDA或10nmol/L雷帕霉素對ERK的磷酸化均無明顯影響，但兩藥一旦聯用，則能協同下調ERK的磷酸化水平(圖5、表1)。說明兩藥聯用能通過抑制Akt/mTOR、ERK信號通路而發(fā)揮抗T-ALL作用。

表1 IDA單用及聯用雷帕霉素處理Jurkat細胞24 h磷酸化Akt、ERK1/2蛋白的半定量表達Table 1 Semi-quantitation of phosphorylation levels of Akt and ERK1/2 in Jurkat cells after treatment of IDA and/or rapamycin for 24 hours

3 討論

近年來研究發(fā)現，雷帕霉素可與傳統(tǒng)化療藥物存在著協同作用。在多發(fā)性骨髓瘤中，雷帕霉素能夠協同地塞米松引起細胞凋亡［7-8］;NPM-ALK陽性的間變性大細胞淋巴瘤易產生地塞米松的耐藥，而雷帕霉素能克服其耐藥并增強了地塞米松誘導凋亡的作用［9］;在B-ALL的非肥胖性糖尿病/重度聯合免疫缺(NOD/SCID)小鼠模型中，雷帕霉素的衍生物RAD001與長春新堿聯用，可明顯延長小鼠的生存時間［10］。

本研究經CCK-8實驗證實，低濃度的雷帕霉素能顯著增強IDA對Jurkat細胞的增殖抑制作用。IDA與雷帕霉素兩者聯用時能明顯抑制細胞的增殖，聯合指數小于1。但這種協同作用主要發(fā)生在IDA濃度較低時，當IDA劑量超過半數抑制濃度后，兩者聯合用藥幾乎沒有作用，這提示低濃度雷帕霉素與小劑量IDA聯用，有助于提高療效，減低IDA的毒副反應。

本研究利用AV/PI染色流式細胞儀檢測發(fā)現，雖然單用雷帕霉素不能引起Jurkat細胞明顯凋亡，但能顯著增強IDA的誘導凋亡作用;電鏡形態(tài)學觀察也證實了雷帕霉素對IDA誘導凋亡的增強作用。

細胞凋亡是多細胞生物體內的一個重要生命現象，胱天蛋白酶Caspases被認為是凋亡的中心實施者。依據凋亡信號起源的不同，細胞凋亡的Caspase通路分為細胞外(死亡受體)和細胞內(線粒體)通路。細胞色素C的釋放可以啟動Caspase的細胞內通路(線粒體途徑)。細胞色素C一旦釋放即與細胞凋亡蛋白酶活化因子-l(Apaf-1)結合，活化Caspase9，繼而激活下游 Caspase3和 Caspase7，誘導細胞凋亡［11］。Caspase的細胞外通路(細胞膜途徑)是由Fas/FasL信號或TNF/TNFR-1信號啟動，通過胞質中Fas相關死亡域(FADD)與Caspase8結合，使Caspase8自身裂解而活化，然后激活下游的Caspase3導致細胞凋亡。

在本實驗中，IDA聯用雷帕霉素較IDA單用更顯著地激活了Caspase3和底物聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶PARP(poly ADP-ribosepolymerase)，再一次證實了雷帕霉素對IDA引起凋亡的增敏作用。而Caspase8和Caspase9在兩藥聯用組都呈現出最明顯的激活，這說明兩藥聯用后是通過細胞膜和線粒體雙途徑影響細胞凋亡的。

既往研究認為，蒽環(huán)類藥物在某些實體腫瘤中可激活Akt/mTOR和MAPK/ERK信號通路而產生耐藥性。與Akt/mTOR信號類似，MAPK/ERK信號的異常激活也常與白血病細胞的增殖和耐藥相關［1-4］。本實驗在Jurkat細胞株中檢測了IDA對Akt/mTOR和ERK信號通路的活化狀態(tài)的影響，結果發(fā)現IDA能促進Akt和S6K蛋白的磷酸化，明確了IDA對Akt/mTOR信號通路活化的作用，而聯用雷帕霉素能使P70S6K和Akt酸化水平明顯降低。此外，單用小劑量的IDA和雷帕霉素對ERK的磷酸化均無明顯影響，但兩藥一旦聯用，則能協同下調ERK的磷酸化水平。這說明兩藥聯用能通過抑制Akt/mTOR、ERK信號通路而發(fā)揮抗T-ALL作用。

本研究證實，雷帕霉素和IDA對 T-ALL Jurkat細胞的生長抑制具有協同作用。兩藥聯用時能通過線粒體和細胞膜雙途徑增強凋亡效應。此外，雷帕霉素能逆轉IDA引起的Akt/mTOR信號通路的激活，并協同抑制ERK信號的活化，為臨床上兩藥的聯用提供了體外實驗證據。

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