劉友群，周方，趙宏飛，展海寧，張柏林

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

乳酸菌發(fā)酵代謝合成葉酸的影響因素

劉友群，周方，趙宏飛，展海寧，張柏林

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

對(duì)嗜酸乳桿菌以及乳酸乳球菌發(fā)酵合成葉酸的影響因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，乳酸菌代謝合成葉酸的產(chǎn)率為17～100 μg/L，菌種、培養(yǎng)時(shí)間、pH值、對(duì)氨基苯甲酸（PABA）質(zhì)量濃度會(huì)影響乳酸菌合成葉酸的產(chǎn)量。與乳酸乳球菌乳酸亞種相比，嗜酸乳桿菌CH-2生成的葉酸產(chǎn)量要高。不同菌株生成葉酸的能力與pH值有關(guān)，嗜酸乳桿菌在pH值為4.2葉酸產(chǎn)率明顯下降，乳酸乳球菌乳酸亞種產(chǎn)葉酸的能力則不受pH值影響。添加PABA可以顯著提高乳酸菌的葉酸產(chǎn)率。選擇適宜的乳酸菌菌株，優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)可以提高乳及相關(guān)食品中葉酸的質(zhì)量濃度，達(dá)到生物方式強(qiáng)化葉酸的效果。

葉酸；乳酸菌；pH值；對(duì)氨基苯甲酸

0 引言

葉酸是指四氫葉酸及其衍生物，屬B族維生素，是介導(dǎo)一碳單位轉(zhuǎn)移極其重要的輔助因子[1]。葉酸被機(jī)體吸收后以輔酶形式參與一碳單位轉(zhuǎn)移，對(duì)核苷酸和蛋白質(zhì)的生物合成及細(xì)胞的分裂生長具有特別重要的作用[2]。葉酸缺乏可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管畸形[3]、巨幼紅細(xì)胞性貧血，且與心血管疾病、老年性癡呆、直腸癌及子宮頸癌密切相關(guān)[4-7]。膳食葉酸對(duì)人類至關(guān)重要，這是因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞不能合成葉酸，但組織的生長需要大量葉酸。植物和微生物可以合成葉酸，是膳食葉酸的重要來源。如植物中的甘藍(lán)、柑橘、大麥、扁豆等。微生物中如酵母產(chǎn)葉酸可達(dá)5.16～60.54 μg/g干菌體[8，9]，乳酸菌產(chǎn)葉酸可達(dá)17～100 μg/L[10]。

本研究從菌種、pH值、對(duì)氨基苯甲酸等條件入手，研究乳酸菌代謝合成葉酸的影響因素，為優(yōu)化葉酸產(chǎn)量工藝以及改善膳食攝入的葉酸途徑提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

菌株為工業(yè)微生物菌種資源共享平臺(tái)保存的乳酸菌菌株，乳酸乳球菌乳酸亞種0231及嗜酸乳桿菌0019（CH-2）。

培養(yǎng)基為乳酸乳球菌乳酸亞種用培養(yǎng)基M17進(jìn)行培養(yǎng)和菌株CH-2用培養(yǎng)基MRS進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 方法

（1）發(fā)酵液中葉酸質(zhì)量濃度的檢測。

樣品前處理：發(fā)酵液中加入提取緩沖液（濃度為0.05 mol/L磷酸緩沖液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%抗壞血酸鈉），50℃，攪拌提取1 h；離心8 000 g，10 min；上清液用雞胰酶酶解1 h，37℃；離心1 000 g，10 min；取上清液0.45 μm膜過濾。

色譜條件：高效液相色譜儀；流動(dòng)相：甲醇與濃度0.05 mol/L磷酸二氫鉀的比為10︰90（pH值為6.4）；色譜柱為C18柱（25 cm×4.6 mm，5 μm球形填料,迪馬鉆石柱）；流速為1 mL/min；二極管陣列檢測器為280 nm。

（2）菌種。

使用前將菌株CH-2、乳酸乳球菌乳酸亞種按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量分別轉(zhuǎn)接至MRS和M17培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)14 h，使菌株活力得到充分恢復(fù)，將已活化好的菌種以2℅接種量轉(zhuǎn)入MRS或M17培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)14 h后離心（6 000 r/min，20 min）收集菌體。將收集到的菌體懸浮于滅菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.5‰生理鹽水中，調(diào)節(jié)菌數(shù)至108mL-1，然后按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量分別接入液體MRS或M17培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)12 h，根據(jù)樣品前處理所述方法取樣，采用HPLC法檢測發(fā)酵液中葉酸質(zhì)量濃度。

（3）培養(yǎng)時(shí)間。

采用吸光光度法測定菌體生長。用分光光度計(jì)，在波長600 nm下，以未接種的標(biāo)準(zhǔn)0管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，測定標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管的光密度值。將活化好的菌株CH-2、乳酸乳球菌乳酸亞種按2%接種量分別接入液體MRS和M17培養(yǎng)基中，按一定時(shí)間間隔取樣，600 nm處測定吸光值，同時(shí)取樣測其葉酸質(zhì)量濃度。

（4）初始pH值。

將活化好的菌株CH-2、乳酸乳球菌乳酸亞種按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量分別接入pH值為4.2，5.2及6.2的液體MRS和M17培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24 h，按一定時(shí)間間隔取樣，測定其OD值及葉酸質(zhì)量濃度，以pH值為6.2時(shí)的結(jié)果作為對(duì)照。

（5）添加PABA對(duì)葉酸產(chǎn)率的影響。

分別接種CH-2、乳酸乳球菌乳酸亞種于MRS或M17液體培養(yǎng)基，其中將3%對(duì)氨基苯甲酸（PABA）加入到MRS或M17培養(yǎng)基中，從第4小時(shí)開始，每2 h取樣檢測葉酸質(zhì)量濃度。

每次實(shí)驗(yàn)過程中取樣重復(fù)3次，取其平均值，并在結(jié)果中標(biāo)示標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的影響

圖1為不同菌株對(duì)葉酸差率的影響。由圖1可以看出，不同菌株發(fā)酵代謝葉酸產(chǎn)率不同，CH-2發(fā)酵12 h時(shí)葉酸產(chǎn)量為15.0 μg/L，乳酸乳球菌乳酸亞種為14.0 μg/L，兩種菌株之間產(chǎn)量差異遠(yuǎn)大于各自平行實(shí)驗(yàn)間的偏差，可認(rèn)為嗜酸乳桿菌CH-2葉酸產(chǎn)率略高于乳酸乳球菌乳酸亞種。菌株之間的差異性與M Y Lin等的研究結(jié)果一致，他們所選取的德氏乳桿菌保加利亞亞種448與嗜熱鏈球菌MC在復(fù)原脫脂乳中培養(yǎng)分別得到葉酸為69.0 ng/mL、59.0 ng/mL。正因?yàn)榫曛g存在差異，所以篩選葉酸高產(chǎn)菌株是研究的微生物代謝葉酸的重點(diǎn)之一。

圖1 不同菌株對(duì)葉酸產(chǎn)率的影響

2.2 培養(yǎng)時(shí)間

將活化好的菌株CH-2、乳酸乳球菌乳酸亞種按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量分別接入液體MRS、M17培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h取發(fā)酵液測定其OD600值及葉酸質(zhì)量濃度。圖2和圖3為培養(yǎng)時(shí)間對(duì)CH-2和乳酸乳球菌乳酸亞種葉酸產(chǎn)率的影響。

圖2 對(duì)CH-2葉酸產(chǎn)率的影響

圖3 對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種葉酸產(chǎn)率的影響

圖5 pH值對(duì)CH-2葉酸產(chǎn)量的影響

圖6 乳酸乳球菌乳酸亞種在不同pH條件下的生長曲線

圖7 pH值對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種葉酸產(chǎn)量的影響

由圖2和圖3可以看出，兩株菌都在2 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，幾乎都是在14 h左右結(jié)束對(duì)數(shù)生長期，轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期。乳酸乳球菌乳酸亞種菌體總數(shù)稍低于CH-2。6 h左右葉酸產(chǎn)量達(dá)到最高，菌體生長處于對(duì)數(shù)生長期前期，菌體合成大量葉酸以滿足繁殖對(duì)葉酸的需求。6 h前葉酸合成速度大于葉酸消耗速度，6 h后合成速度低于消耗速度，所以葉酸質(zhì)量濃度下降。14 h后菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，繁殖速度降低，葉酸的需求量減小，合成量也減少，所以隨著時(shí)間延長葉酸質(zhì)量濃度逐步下降。

2.3 初始pH值

將活化好的菌株CH-2、乳酸乳球菌乳酸亞種按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量分別接入pH值為4.2，5.2，6.2的液體MRS和M17培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24 h，測定其OD值及葉酸質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖4～圖7。

由圖4～圖7可以看出，當(dāng)接種時(shí)初始pH值為6.2或pH值為5.2，兩個(gè)菌種葉酸產(chǎn)量均較初始pH值為4.2時(shí)高，且pH值對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種的影響要比其對(duì)嗜酸乳桿菌影響小一些。初步分析可能存在兩個(gè)方面的原因：第一，培養(yǎng)基接種pH值為4.2時(shí)乳酸菌生長受到一定的抑制，由圖4和圖6中初始pH值對(duì)乳酸菌生長的影響可以看出；第二，pH值低于4.5時(shí)，葉酸不穩(wěn)定，容易分解。

2.4 對(duì)氨基苯甲酸（PABA）

分別接種CH-2、乳酸乳球菌乳酸亞種于MRS、M17液體培養(yǎng)基和加入3%對(duì)氨基苯甲酸的MRS液體培養(yǎng)基中，從第4 h開始，每2 h取樣檢測葉酸質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖8和圖9所示。

圖8 PABA對(duì)CH-2代謝葉酸的影響

圖9 PABA對(duì)乳酸乳球菌乳酸亞種代謝葉酸的影響

由圖8和圖9可知，對(duì)氨基苯甲酸（PABA）可顯著提高乳酸菌發(fā)酵代謝葉酸的產(chǎn)量，提高大約2倍。微生物細(xì)胞中葉酸的合成是利用自身的喋呤、對(duì)氨基苯甲酸(PABA)和谷氨酸在葉酸合成酶的作用下完成的，嘌呤經(jīng)過一系列代謝合成蝶呤，分支酸結(jié)合谷氨酰胺在脫氧分支酸合酶（ADCS）作用下合成對(duì)氨基苯甲酸（PABA）；其次，蝶呤與PABA在二氫蝶酸合酶作用下合成二氫蝶酸；最后，二氫蝶酸結(jié)合谷氨酸在二氫葉酸合成酶的作用下合成二氫葉酸，進(jìn)而在二氫葉酸還原酶催化下生成四氫葉酸[11-16]。Arno Wegkamp等從基因?qū)用孀C實(shí)過量表達(dá)PABA合成基因，可大大提高乳酸菌的葉酸合成量。由此可知，PABA是合成葉酸的直接前體物質(zhì)，在培養(yǎng)基中加入PABA可以加快葉酸的合成，提高發(fā)酵液中葉酸的質(zhì)量濃度。

3 結(jié)論

部分乳酸菌株具有代謝生成葉酸的能力，葉酸的產(chǎn)量存在菌株差異性，且受到發(fā)酵時(shí)間、初始pH值以及前體物質(zhì)對(duì)氨基苯甲酸（PABA）等因素的影響。因此，選擇適宜的菌株，優(yōu)化培養(yǎng)條件可以提高載體中的葉酸產(chǎn)量。

[1] BEKAERT S，STOROZHENKO S，MEHRSHAHI P,et al.Folate Bioforlification in Food Plan[J].Trend Plant Sci.,2007,13:1360-1385.

[2] HANSON A D.ROJE S.One-Carbon Metabolism in Higher Plants[J].Annu.Rev.Plant Physio1.Plant Mol.Biol.，2001，52：119-137.

[3] 熊惠玲，馬艷.出生缺陷的病因?qū)W研究進(jìn)展[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29(8)：765-766.

[4] DUSHIE SJ,NARAYANA NS,BRAND GM,et al.Impact of Folate Deficiency on DNA Stability[J].Nutr.,2002,132(1):2448-2449.

[5] GIOVAMN CCIE.Epidemiologic Studies of Folate and Colorectal Neoplasia-a Review[J].Nutr.,2002,132(1):2350S-2355S

[6] FANG J Y,XIAO S D.Alteration of DNA Methylation in Gastrointestinal Carcinogenesis[J].Castroenterol.Hepatol,2001,16(9):960-968.

[7] LEVIN B.An overview of preventive strategies for pancreatic cancer[J].Ann Oncol,1999,10(4):193-196.

[8] 方尚玲.葉酸及其檢測[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2000（1）:8-12.

[9] 吳周和，吳傳茂，李小燕，等.酵母發(fā)酵制備葉酸功能食品的研究[J].食品科學(xué)，2004,25(1):78-81.

[10] LIN M Y,YOUNG C M.Folate Levels in Cultures of Lactic Acid Bacteria[J].International Dairy Journal,2000(10)；409-413.

[11] 闞靜,李莉,許激揚(yáng).葉酸的生物合成及其代謝工程研究進(jìn)展[J].中國生化藥物雜志.2009,30(4):284-286.

[12] QUINLIVAN E P,ROJE S,BASSET G,et al.The Folate Precursor P-Aminobenzoate is Reversibly Converted to Its Glucose Ester in the Plant Cytosol[J].J.Biol Chem,2003,278(23):20731-20737.

[13] BASSET G J C,QUINLIVAN E P,RAVANEL S,et al.Folate Synthesis in Plants:The P-Aminobenzoate Branch is Initiated by a Bifunctional PabA2PabB Protein That Is Targeted to Plastids[J].PNAS,2004,101(6):1496-1501.

[14] WEGKAMP A,VAN OORSCHOT W,DE VOS W M,et al.Characterization of the Role of Para-Aminobenzoic Acid Biosynthesis in Folate Production byLactococcus lactis[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(8):2673-2681.

[15] KLAUS S M J,WEGKAMP A,SYBESMA W,et al.A Nudix Enzyme Removes Pyrophosphate from Dihydroneopterin Triphosphate in the Folate Synthesis Pathway of Bacteria and Plants[J].J.Biol.Chem,2005,280(7):5274-5280.

[16] BABAL T,ARAL T,HASEGAWAL M,et al.Construction of Escherichia coli K-12 in-frame,Single-Gene Knockout Mutants:the Keio Collection[J].Mol Syst.Biol,2006,0008:1-11.

Factors affecting the production of folic acid bylactic acid bacteria

LIU You-qun,ZHOU Fang,ZHAO Hong-fei,ZHAN Hai-ning,ZHANG Bo-lin
(College of Biological Sciences&Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

The factors affecting the synthesis of folic acid byLactobacillus acidophilusandLactococcus lactissubsp.lactiswere studied.Lactic acid bacteria produced folate of 17～100 μg/L by fermentation,depending on strains,fermentation time,pH and para-aminobenzoic acid(PABA).L.acidophilus strainCH-2 produced more folic acid thanL.lactissubsp.lactisdid.L.acidophilusCH-2 significantly had a low folate yield as pH in media decreased to 4.2,whereas the level of folic acid produced byL.lactissubsp.lactismight be pH-independent.Addition of PABA to media significantly improved the yields of folic acids formed by twolactic acid bacteria.The present study means that use of folateproducing strains,in combination with good fermentation,can fortify the contents of folic acid from milk or related foods.

folic acid;Lactic acid bacteria;pH;para-aminobenzoic acid(PABA)

Q93-335

A

1001-2230（2011）03-0010-04

2010-11-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）“益生菌定向篩選與功能開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)（2008AA10Z335）”項(xiàng)目。

劉友群（1986-），女，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究工作。

張柏林