張伊寧，趙新淮

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

酪蛋白與明膠的酶促交聯(lián)與產(chǎn)物的流變學性質(zhì)

張伊寧，趙新淮

（東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對酪蛋白和明膠進行酶促混合交聯(lián)。在酪蛋白與明膠比例為4︰1（質(zhì)量比）時，以交聯(lián)產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)為指標，采用單因素試驗研究酶添加量、反應時間和溫度對交聯(lián)反應的影響。優(yōu)化后的適宜交聯(lián)條件為：底物質(zhì)量濃度固定為50 g/L，酶添加量為每克蛋白質(zhì)20 U，反應時間為4 h，溫度為45℃。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明產(chǎn)物中含有蛋白質(zhì)聚合物。與原料酪蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶促交聯(lián)的酪蛋白相比，所得到的產(chǎn)物的分散液表觀黏度和黏彈性均有顯著的改變，表明轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的酪蛋白和明膠混合可以用于改善其流變學性質(zhì)。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；酪蛋白；明膠；交聯(lián)；流變學性質(zhì)

0 引言

蛋白質(zhì)交聯(lián)是通過一定的化學試劑或催化劑，在蛋白質(zhì)分子之間或分子內(nèi)形成共價鍵[1]，它可以影響食品蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[2]。常用的方法有化學法和酶法，且酶法大多采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶[3]。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（EC 2.3.2.13，TG）能夠催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間形成-（γ-谷氨?；┵嚢彼峁矁r鍵[4，5]。利用它處理后的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)變化[6]，制作的食用膜有較好的阻水性[7]，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)更為緊密[8]或者是強度增強[9]。采用TG交聯(lián)單一蛋白質(zhì)的研究較多，而對兩種以上蛋白質(zhì)的混合交聯(lián)則不多。本研究利用TG催化酪蛋白與明膠混合交聯(lián)，以產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)為指標，單因素試驗確定適宜的反應條件，用電泳驗證交聯(lián)反應的發(fā)生，并對交聯(lián)產(chǎn)物的流變學性質(zhì)進行評價。

1 實驗

1.1 材料

酪蛋白（蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)89.4%），明膠（蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)90.6%，等電點pH值為8.0～9.0），轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，L-羥脯氨酸，其他化學試劑均為分析純。

1.2 主要設(shè)備

UV-2401PC型紫外可見分光光度計，Gemini II高級流變儀，AL204型分析天平，Alpha 1-4中型凍干機，HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱，DELTA 320型精密pH計，H-1型微型漩渦混合器，DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋。

2 方法

2.1 交聯(lián)反應條件的優(yōu)化

2.1.1 酪蛋白與明膠的混合交聯(lián)

分別配置蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度50 g/L的酪蛋白與明膠溶液，用濃度為0.2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5，二者以4︰1體積比混合。然后采用單因素實驗，通過測定反應后交聯(lián)產(chǎn)物中羥脯氨酸的質(zhì)量分數(shù)，考察酶添加量、反應時間和反應溫度的影響作用，以確定適宜的交聯(lián)反應條件，并在優(yōu)化的條件下制備混合交聯(lián)蛋白質(zhì)。反應結(jié)束后樣品在沸水浴加熱15 min滅酶，冷卻至室溫。

用濃度為1 mol/L的HCl將樣品溶液pH值調(diào)至4.6，使交聯(lián)酪蛋白等電點沉淀并除去未混合交聯(lián)的明膠，11 000 g離心15 min，棄去上清液，重復2次，沉淀為交聯(lián)產(chǎn)物（混合交聯(lián)蛋白），100℃烘干至恒重。

2.1.2 羥脯氨酸的測定

稱取100 mg樣品于水解管中，加入4 mL濃度為7.5 mol/L的HCl和1 mL質(zhì)量分數(shù)為5%苯酚，封口后置于110℃下水解24 h，取出后用濃度為10 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.0并且定容至25 mL，用乙酸鹽-檸檬酸鹽緩沖溶液（濃度為0.88 mol/L乙酸鈉，0.24 mol/L檸檬酸，0.21 mol/L乙酸和0.85 mol/L氫氧化鈉，pH值6.0）稀釋到適當濃度。取2 mL稀釋液于試管中，加入1 mL氯胺-T溶液（濃度為0.06 mol/L氯胺-T溶于體積分數(shù)為50%的正丙醇），混勻后室溫下反應20 min；再加入2 mL對二甲氨基苯甲醛試劑（濃度為0.05 mol/L對二甲氨基苯甲醛，濃度為3.7 mol/L高氯酸溶于體積分數(shù)為60%的正丙醇），搖勻，60℃恒溫水浴中反應20 min。迅速冷卻，550 nm處測定吸光值，平行3次。

以L-羥脯氨酸為標準品，配置不同濃度的L-羥脯氨酸標準溶液，同上測定。以L-羥脯氨酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線[10]。

2.1.3 SDS-PAGE分析

采用穩(wěn)壓法電泳。分離膠質(zhì)量分數(shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分數(shù)4%，低分子量標準蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為0.1 g/L，樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為5 g/L，每孔進樣10 L。樣品在濃縮膠時電壓為80 V，待溴酚藍前沿進入分離膠后，加壓至120 V，待溴酚藍距離下緣0.5～1.0 cm時結(jié)束電泳。膠片取下后固定30 min，染色6 h，然后脫色直至條帶清晰、背景色完全褪去為止，并在凝膠系統(tǒng)成像[11]。

2.2 交聯(lián)產(chǎn)物的流變學性質(zhì)測定

2.2.1 表觀黏度與剪切速率關(guān)系曲線

配制質(zhì)量濃度為10 g/L的混合交聯(lián)蛋白質(zhì)分散液、質(zhì)量濃度為100 g/L的交聯(lián)酪蛋白分散液和質(zhì)量濃度為120 g/L的酪蛋白分散液，調(diào)節(jié)pH值至7.0。測試選用夾具為平板（直徑20 mm），測試間距為500 μm，剪切速率的范圍為0.1 s-1～100 s-1[12]，取30個點進行測試。

2.2.2 黏彈性

振幅掃描：配制質(zhì)量濃度為10 g/L的混合交聯(lián)蛋白質(zhì)分散液、100 g/L的交聯(lián)酪蛋白分散液、100 g/L和120 g/L的酪蛋白分散液。測試夾具和間距同2.2.1，測定參數(shù)條件如下：應變范圍為0.1%～100%，在頻率為1 Hz的條件下進行振幅掃描。

頻率掃描：測試夾具和間距同2.2.1，用振幅掃描試驗確定出線性黏彈區(qū)內(nèi)的最優(yōu)應變值進行頻率掃描測試，頻率范圍為0.1～5 Hz。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件中Duncan’s multiple range tests對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析（α=0.05），利用Excel 2003軟件繪圖報告結(jié)果，其中每組試驗重復數(shù)為3次。

3 結(jié)果與討論

在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的作用下，理論上，不僅酪蛋白、明膠可以發(fā)生交聯(lián)反應，酪蛋白和明膠之間也可以發(fā)生交聯(lián)反應。羥脯氨酸是機體膠原蛋白的主要成分之一，而在其它蛋白中則不存在[13]。明膠中含有羥脯氨酸，酪蛋白中并無此種氨基酸。由于明膠的等電點在8～9，所以pH值4.6下的酸沉淀處理，可以除去未與酪蛋白結(jié)合的明膠。故此，測定混合交聯(lián)產(chǎn)物中的羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)，不僅可以證實明膠與酪蛋白之間發(fā)生交聯(lián)反應，還可以衡量出混合交聯(lián)蛋白中明膠的相對水平。

3.1 反應條件對交聯(lián)產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的影響

3.1.1 酶添加量

在底物質(zhì)量濃度為50 g/L，50℃下反應時間4 h時，酶添加量對交聯(lián)產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的影響如圖1所示。由圖1可以看出，隨著酶添加量的增加，產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)也增加。酶添加量從每克蛋白質(zhì)5 U增加到20 U時，羥脯氨酸的質(zhì)量分數(shù)從34.64 mg/g增加到41.29 mg/g。但當酶添加量高于每克蛋白質(zhì)20 U時，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)并無顯著性增加，故此選擇酶添加量為每克蛋白質(zhì)20 U。

圖1 酶添加量對羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的影響

3.1.2 反應時間

在底物質(zhì)量濃度為50 g/L，酶添加量為每克蛋白質(zhì)20 U，反應溫度為50℃的條件下，反應時間對交聯(lián)產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的影響如圖2所示。由2可以看出，隨著反應時間的延長，產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)也隨之增加，從28.16 mg/g增加到37.40 mg/g；反應超過4 h后，產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)無顯著性增加。所以適宜的反應時間確定為4 h。

圖2 時間對羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的影響

3.1.3 反應溫度

在底物質(zhì)量濃度為50 g/L、酶添加量為每克蛋白質(zhì)20 U，反應時間為4 h時，研究反應溫度（40～60℃）對交聯(lián)產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，當溫度從40℃升高到50℃時，產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)增加；當溫度高于50℃時，羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)反而下降。這種現(xiàn)象與酶自身的特性相符，即在適宜的溫度下活力最高，當溫度高于最適溫度時，酶的活力反而下降。當反應溫度為45℃時，產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)為40.69 mg/g；而反應溫度為50℃時，產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)為41.46 mg/g。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，二者并無顯著性差異，所以選擇45℃為反應溫度。

圖3 溫度對羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的影響

通過上述分析可知，當酪蛋白與明膠質(zhì)量濃度固定為50 g/L時，混合交聯(lián)反應的最優(yōu)條件：酶添加量為每克蛋白質(zhì)20 U，反應時間為4 h，反應溫度為45℃。

3.2 SDS-PAGE電泳分析

在優(yōu)化條件下制備混合交聯(lián)蛋白質(zhì)，同時按照這個條件制備交聯(lián)酪蛋白。將混合交聯(lián)蛋白、交聯(lián)酪蛋白、酪蛋白同時進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，混合交聯(lián)蛋白質(zhì)（泳道1）與交聯(lián)酪蛋白（泳道2）中均有分子質(zhì)量大于97.4 ku的蛋白質(zhì)存在，并且沒有酪蛋白的特征條帶，而酪蛋白（泳道3）中則沒有分子質(zhì)量大于97.4 ku的蛋白質(zhì)存在。這說明在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶作用下生成了交聯(lián)蛋白。Chambi等[14]用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化明膠和酪蛋白交聯(lián)制備可食性薄膜，SDS-PAGE分析顯示交聯(lián)樣品有分子質(zhì)量大于212 ku的蛋白質(zhì)。Jiang等[15]在葡萄糖胺存在下用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化大豆分離蛋白，SDS-PAGE分析結(jié)果產(chǎn)物中也有分子質(zhì)量大于97.4 ku的蛋白質(zhì)聚合物。本研究結(jié)果與這兩個研究的結(jié)果一致，即轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶有效地催化底物生產(chǎn)交聯(lián)蛋白。

圖4 SDS-PAGE分析結(jié)果

3.3 交聯(lián)產(chǎn)物的流變學性質(zhì)

3.3.1 表觀黏度

在0.1 s-1～100 s-1的剪切速率下，3種蛋白質(zhì)分散液的表觀黏度與剪切速率關(guān)系如圖5所示。圖5中，3種不同蛋白質(zhì)分散液的表觀黏度的大小順序為：10 g/L混合交聯(lián)蛋白質(zhì)＞100 g/L交聯(lián)酪蛋白＞120 g/L酪蛋白。顯然，若分散液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度一致，混合交聯(lián)蛋白質(zhì)分散液的表觀黏度會更大。蛋白質(zhì)分散液的表觀黏度受蛋白質(zhì)分子大小，溶劑-蛋白質(zhì)間相互作用，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的影響[16]。酶促交聯(lián)形成了大分子物質(zhì)，導致蛋白質(zhì)分散液表觀黏度增大；由于明膠的引入，混合交聯(lián)產(chǎn)物的表觀黏度有了顯著增加。所以，交聯(lián)產(chǎn)物具有更好的增稠作用。

圖5 表觀黏度與剪切速率曲線

3.3.2 黏彈性

在0.1～5 Hz的頻率范圍內(nèi)，測定混合交聯(lián)蛋白質(zhì)、交聯(lián)酪蛋白和酪蛋白分散液的黏彈性，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，3個蛋白質(zhì)分散液的黏性模量、彈性模量由大到小的順序為：混合交聯(lián)蛋白質(zhì)分散液、交聯(lián)酪蛋白分散液、酪蛋白分散液。黏彈性的變化是由于酶促交聯(lián)形成的大分子蛋白質(zhì)物質(zhì)，使黏彈性增加。明膠本身具有很好的黏性和彈性，所以混合交聯(lián)蛋白質(zhì)中由于明膠的引入，使其黏彈性有了很大程度的增加。這些結(jié)果進一步表明，交聯(lián)產(chǎn)物具有更好的增稠作用。

圖6 三種蛋白質(zhì)分散液的黏性模量和彈性模量曲線

4 結(jié)論

（1）利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化酪蛋白與明膠進行混合交聯(lián)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，產(chǎn)物中含有蛋白質(zhì)聚合物?；瘜W分析表明，交聯(lián)產(chǎn)物中含有一定數(shù)量的羥脯氨酸，表明有明膠與酪蛋白交聯(lián)結(jié)合。

（2）通過對交聯(lián)產(chǎn)物中羥脯氨酸質(zhì)量分數(shù)的評價，在酪蛋白與明膠溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為50 g/L，二者體積比為4︰1的條件下，單因素實驗得到的最適反應條件為：酶添加量為每克蛋白質(zhì)20 U，反應時間4 h，反應溫度45℃。

（3）混合交聯(lián)蛋白質(zhì)的流變學性質(zhì)得到改善。流變學分析結(jié)果表明，混合交聯(lián)蛋白質(zhì)的分散液具有顯著增加的表觀黏度、黏性模量、彈性模量。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化酪蛋白和明膠的交聯(lián)產(chǎn)物，具有更好增稠作用，具有潛在的應用價值。

[1] FEENEY R E,WHITAKER J R.Importance of Cross-Linking Reactions in Proteins[M]//In Ad vances in Cereal Science and Technology：Volume IX.American Association of Cereal Chemists,Inc.:St Paul,USA，1988.

[2] GERRARD J A,MEADE S J,MILLER A G,et al.Protein Cross-Linking in Food[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2005,1043:97-103.

[3] GERRARD J A.Protein-Protein Crosslinking in Food:Methods,Consequences,Applications[J].TrendsinFoodScienceand Technology,2002,13(12):391-399.

[4] DICKINSON E.Enzymic Cross-Linking as a Tool for Food Colloid Rheology Control and Interfacial Stabilization[J].Trends in Food Science and Technology,1997,8(10):334-339.

[5] MOTOK M,SEGURO K.Transglutaminase and Its Use for Food Processing[J].Trends in Food Science and Technology,1998,9(5):204-210.

[6] HINZ K,HUPPERTZ T,KULOZIK U,et al.Influence of Enzymatic Cross-Linking on Milk Fat Globules and Emulsifying Properties of Milk Proteins[J].International Dairy Journal,2007,17(4):289-293.

[7] 李紅.利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶生產(chǎn)大豆蛋白食用保鮮膜的研究[J].食品科學,2001,22(1):73-75.

[8] FARNSWORTH J P,LI J,HENDRICKS M.Effects of Transglutaminase Treatment on Functional Properties and Probiotic Culture Survivability of Goat Milk Yogurt[J].Small Ruminant Research,2006,65(1-2):113-121.

[9] JONGJAREONRAK A,BENJAKUL S,VISESSANGUAN W,et al.Skin Gelatin from Bigeye Snapper and Brownstripe Red Snapper:Chemical Compositions and Effect of Microbial Transglutaminase on Gel Properties[J].Food Hydrocolloids,2006,20(8):1216-1222.

[10] EDWARDSCA,O’BRIENWD.ModifiedAssayfor Determination of Hydroxyproline in a Tissue Hydrolyzate[J].Clinica Chimica Acta,1980,104(2):161-167.

[11] LAEMMLI U K.Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4[J].Nature,1970,227(5259):680-685.

[12] PURWANDARI U,SHAH N P,VASILJEVIC T.Effects of Exopolysaccharide-Producing Strains of Streptococcus thermophilus on Technological and Rheological Properties of Set-Type Yoghurt[J].International Dairy Journal,2007,17(11):1344-1352.

[13] 楊秀穎,杜冠華.組織羥脯氨酸含量微量測定方法及應用[J].中國藥理學通報,2004,20(7):836-837.

[14] CHAMBI H,GROSSO C.Edible Films Produced with Gelatin and Casein Cross-Linked with Transglutaminase[J].Food Research International,2006,39(4):458-466.

[15] JIANG S J,ZHAO X H.Transglutaminase-Induced Cross-Linking and Glucosamine Conjugation in Soybean Protein Isolates and Its Impacts on some Functional Properties of the Products[J].European Food Research and Technology,2010,231(5):679-689.

[16] DAMODARAN S.Amino Acids,Peptides and Proteins[M]//In Food Chemistry：3rd edition.Inc.，New York,USA，1996.

Transglutaminase-induced cross-linking of casein and gelatin and rheological properties of the products

ZHANG Yi-ning，ZHAO Xin-huai
(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Cross-linking of casein and gelatin catalyzed by transglutaminase was studied in this work.When the ratio of casein to gelatin was fixed at 4∶1(w/w)and the content of hydroxyproline in the obtained product was used as index,the addition level of transglutaminase,reaction temperature and time were studied by single factor experiments.The optimal cross-linking conditions obtained were that protein concentration was fixed at 5%(w/v),enzyme addition level was 20 U/g proteins,reaction time was 4 h and reaction temperature was 45℃.SDSPAGE analysis demonstrated that some protein polymers existed in the obtained product.Compared to casein and transglutaminase-induced cross-linked casein,the dispersion of the obtained product exhibited markedly improved apparent viscosity and viscoelastic behaviors.Our result indicated that cross-linking of casein and gelatin could improve their rheological properties.

transglutaminase；casein；gelatin；cross-linking；rheological properties

Q936

A

1001-2230（2011）03-0020-04

2010-11-08

黑龍江省高等學?？萍紕?chuàng)新團隊建設(shè)計劃項目（2010td11）。

張伊寧（1985-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

趙新淮