黃錦標(biāo)，尚龍安

（1浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，浙江 寧波 315100；2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310027）

研究開發(fā)

含苯聚羥基脂肪酸酯的生物合成及其分子結(jié)構(gòu)表征

黃錦標(biāo)1，2，尚龍安1

（1浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，浙江 寧波 315100；2浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江 杭州 310027）

聚羥基脂肪酸酯（PHA）具有可生物降解性和生物相容性，是潛在的醫(yī)學(xué)材料。對聚羥基脂肪酸酯進(jìn)行改性，可提高其應(yīng)用范圍.采用以苯戊酸和蔗糖為混合碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)PseudomonasputidaKT2442，對其細(xì)胞內(nèi)合成的聚羥基脂肪酸酯進(jìn)行生物改性，并利用核磁共振、紅外色譜和氣相色譜分析方法表征了改性的PHA分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明合成的聚羥基脂肪酸酯為含有3-羥基苯戊酸單體的中長鏈聚羥基脂肪酸酯（PHPhA），該單體在PHA鏈中含量為1.04%，為進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。

聚羥基脂肪酸酯；生物改性；惡臭假單胞菌；混合碳源

聚羥基脂肪酸酯（PHA，其結(jié)構(gòu)式如圖 1）是細(xì)菌在營養(yǎng)不平衡下如氮元素限制或碳源充足的培養(yǎng)條件下在細(xì)胞內(nèi)積累的一類作為碳源和能量儲備的聚酯[1]。PHA因其具有可生物降性和生物相容性特點(diǎn)，并且通過改變 PHA中的單體可改變其熱機(jī)械性能[2-4]，因此近年來受到越來也多的關(guān)注。

圖1 PHA分子結(jié)構(gòu)通式（R1，R2為烷基，n=1～4）

PHA雖具有良好的應(yīng)用前景，傳統(tǒng)的PHA產(chǎn)品在性能上還存在某些缺陷，應(yīng)用范圍不廣。如PHB在常溫下的力學(xué)和耐溶劑性能很差；熔融狀態(tài)下不穩(wěn)定，容易分解，加工溫度范圍很窄。通過生物改性可在 PHA鏈中整合特定功能基團(tuán)從而可以改善PHA的熱機(jī)械性能并且可拓寬其應(yīng)用范圍。Shi等[5]利用Alcaligines eutrophus菌株，以 4-羥基丁酸和相對分子質(zhì)量為 200的聚乙二醇（PEG-200）為混合碳源，首次在生物細(xì)胞內(nèi)合成了端基為羥基的 PHA-PEG二元嵌段共聚物。Devang等[6]在發(fā)酵底物中加入乙二醇和 1,2-丙二醇，同樣得到二元嵌段共聚物，TGA分析表明產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性有較大的提高。Ward等[7]利用一系列含苯環(huán)的脂肪酸為碳源來合成PHA，當(dāng)以苯戊酸為碳源時，Pseudomonas putidaCA-3合成的PHA中最高可含有98% 3-羥基苯戊酸單體，聚合物的玻璃化溫度和熔點(diǎn)溫度為 13.2 ℃和 51.5℃。以苯己酸為碳源時，得到的PHA中含有83%的 3-羥基苯己酸單體，其玻璃化溫度和熔點(diǎn)溫度為3.9 ℃和52.1 ℃。

含苯環(huán)基團(tuán)的聚羥基脂肪酸酯（PHPhA）除了具有 PHA共有的生物相容性和生物可降解性等特點(diǎn)外，PHPhA能在體內(nèi)緩慢降解，可作為藥物載體起到藥物緩釋作用[8]。PHPhA在降解的過程中會緩慢釋放諸如苯乙酸和苯丁酸這樣的中間體，這些物質(zhì)已被證明有抗腫瘤、止痛及化學(xué)防癌作用[9-11]，因此具有潛在的醫(yī)用前景。

本文利用以蔗糖和苯戊酸為混合碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基來培養(yǎng)Pseudomonas putidaKT2442，通過在PHA聚合鏈上引進(jìn)芳香基團(tuán)對PHA進(jìn)行生物改性，并利用紅外色譜、核磁共振、氣相色譜等分析手段對改性PHA進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)表征。

1 實驗部分

1.1 實驗菌種及試劑

Pseudomonas putidaKT2442，本實驗室保存。苯戊酸，Sigma公司。氣相標(biāo)準(zhǔn)試劑：PHBV、甲基葵酸、甲基月桂酸、己酸，Sigma公司。其它試劑均為市售分析純。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

蔗糖 15 g/L，KH2PO43 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 1.2 g/L，檸檬酸 5 g/L，苯戊酸 0.5 g/L，pH值調(diào)至6.9～7.2。

1.3 分析儀器

傅里葉紅外光譜儀 Tensor 27、核磁共振儀，Bruker公司；GC2010 plus氣相色譜儀，日本島津；UV-1800紫外分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.4 搖瓶發(fā)酵方法

菌種經(jīng)LB培養(yǎng)基3次以上活化后，轉(zhuǎn)接至500 mL裝液量為200 mL的三角瓶中，在30 ℃，200 r/min的搖床中培養(yǎng)48～50 h，收集細(xì)胞并純化。

1.5 分離純化方法

發(fā)酵液在6000 r/min、10 min的條件下離心，得到的濕細(xì)胞用蒸餾水洗2～3次并離心，凍干。取10～20 g凍干細(xì)胞，以15 mL/g的比例與氯仿混合→放置恒溫振蕩器24 h→抽濾→恒溫可調(diào)加熱器上蒸發(fā)氯仿→待蒸發(fā)到15 mL，倒入10倍體積冰甲醇→對混合液離心 5 min→倒去上清液，沉淀再用少量氯仿溶解→倒入冰甲醇，離心，沉淀用少量氯仿溶解，重復(fù) 4～5次，可得到純度 92%以上的發(fā)酵產(chǎn)物。

1.6 分析方法

紫外分光光度法：稱取0.1 g干細(xì)胞于硝化管中，加入5 mL的濃硫酸，在85 ℃的水浴中反應(yīng)1 h，冷卻至室溫，用去離子水稀釋，在波長為208 nm條件下測其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成樣品的濃度。紅外吸收光譜采用KBr壓片涂膜法。核磁共振光譜分析：溶劑CDCl3，內(nèi)標(biāo)TMS，基團(tuán)的化學(xué)位移通過Shoolery公式[12]來確定。氣相分析的樣品處理：取0.1 g干細(xì)胞放入旋塞試管中，加入2 mL 酸化甲醇（含3% H2SO4，體積比）和2 mL氯仿，在100 ℃水浴條件下反應(yīng)4 h，冷卻至室溫后，加入1 mL的去離子水，在漩渦混合器上震蕩5 min，靜置分層后，取下層進(jìn)行GC分析。

氣相分析條件：采用Restek公司RTX-1色譜柱（30 m×0.25 mm ID，填料為粒徑0.25 μm的100%二甲基聚硅氧烷）；氮?dú)鉃檩d氣；進(jìn)樣量1 μL；氣化溫度230 ℃；氫火焰檢測池溫度280 ℃。柱溫：初始80 ℃保持2 min，再以10 ℃/min 的加熱速率升溫至180 ℃，保持2 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同苯戊酸濃度搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析

圖2 為在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、0.2 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L苯戊酸的搖瓶發(fā)酵結(jié)果。由圖3可以知道，培養(yǎng)基中沒有苯戊酸時， PHA在培養(yǎng)基的濃度最高，為0.658 g/L。隨著培養(yǎng)基中的苯戊酸濃度的升高，所得 PHA的濃度逐次減少。當(dāng)培養(yǎng)基中的苯戊酸濃度為 2 g/L時，PHA在培養(yǎng)基中的濃度僅為0.085 g/L，細(xì)胞濃度為0.21 g/L。由發(fā)酵結(jié)果來看，培養(yǎng)基中苯戊酸的含量對細(xì)胞生長和細(xì)胞內(nèi) PHA的積累有一定的影響。紫外分光法只能測定細(xì)胞內(nèi)總PHA的含量，為確定苯戊酸是否對細(xì)胞合成的 PHA的結(jié)構(gòu)有影響，須進(jìn)一步對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析

圖2 苯戊酸濃度與細(xì)胞生長關(guān)系

圖3 苯戊酸濃度與細(xì)胞內(nèi)PHA含量關(guān)系

2.2.1 發(fā)酵產(chǎn)物紅外光譜分析

圖4 單一碳源的發(fā)酵產(chǎn)物紅外色譜圖

圖5 混合碳源的發(fā)酵產(chǎn)物紅外光譜圖

圖4為以蔗糖為單一碳源的發(fā)酵產(chǎn)物紅外色譜圖，圖5為以苯戊酸和蔗糖為混合碳源的發(fā)酵產(chǎn)物紅外色譜圖。由圖可知，以蔗糖和混合碳源培養(yǎng)的到得發(fā)酵產(chǎn)物在1220～1760 cm－1處有吸收峰，表示發(fā)酵產(chǎn)物為內(nèi)酯聚合物。對比圖4和圖5可知，以混合碳源發(fā)酵得到的產(chǎn)物在1467 cm－1處有吸收峰，此處為苯環(huán)內(nèi)雙鍵特征峰，所以Pseudomonas putidaKT2442以混合碳源為培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物為含有苯環(huán)的聚脂肪酸酯（PHPhA）。

2.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的核磁共振分析

圖6 發(fā)酵產(chǎn)物的100 MHz13C核磁圖譜

圖7 發(fā)酵產(chǎn)物的400 MHz1H核磁圖譜

表1 發(fā)酵產(chǎn)物各個碳的化學(xué)位移

圖6和圖7分別為純度為92%發(fā)酵產(chǎn)物樣品的核磁共振碳譜和氫譜圖。由13C-NMR可知，在δ=173.6，129處有特征峰，1H-NMR譜δ=7.210有特征峰，顯示樣品為含有芳香基的聚酯物。對碳譜（圖 6）上的各個峰進(jìn)行歸屬和定位（表1），由化學(xué)位移可以確定發(fā)酵產(chǎn)物樣品中含有 C4、C5、C6，苯環(huán)連接在C5上，此外，還存在C8、C10、C12中一種或幾種。由1H-NMR譜（圖7）在4.082處有特征峰可知，聚合物中 C4為 4-羥基丁酸單體。結(jié)合1HNMR譜的各化學(xué)位移（表2），發(fā)酵產(chǎn)物樣品的分子式可表示為如圖8[13-15]。

由此可以看出，Pseudomonas putidaKT2442與Pseudomonas fluorescensBM07[6]有相似之處，都能在含有芳香基團(tuán)的混合碳源中生長并合成帶有芳香基的PHA。當(dāng)Pseudomonas fluorescensBM07在含有11-苯氧基十一烷酸混合碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，Pseudomonas fluorescensBM07能合成帶有3-羥基-11-苯氧基十一烷單體的中長鏈 PHA，該單體在PHA中的含量最高可達(dá)10%。Pseudomonas putidaKT2442在含有苯戊酸的混合碳源中合成得到的PHA中為3-羥基苯戊酸單體。

表2 核磁氫譜圖中各峰化學(xué)位移

圖8 發(fā)酵產(chǎn)物分子式

2.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物氣相圖譜分析

為確定聚合物中含芳香基單體PHhv含量，對發(fā)酵樣品進(jìn)行氣相色譜分析。氣相分析采用內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為苯甲酸，保留時間和對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物如表3。圖 9為以蔗糖為單一碳源培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖，圖10為以苯戊酸和蔗糖混合碳源為培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物色譜圖。對比圖 9和圖 10可以知道，Pseudomonas putidaKT2442在單一培養(yǎng)基和混合培養(yǎng)基的產(chǎn)物在氣相色譜中有不同的響應(yīng)峰，在混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的發(fā)酵產(chǎn)物中除了含有C6、C10、C12外，C4在圖譜中也有響應(yīng)。苯戊酸附近存在響應(yīng)峰，進(jìn)一步顯示發(fā)酵產(chǎn)物為帶有苯環(huán)的聚合物（PHPhA）。經(jīng)計算，PHhv在聚合物中的含量為1.04%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

圖9 單一碳源培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物氣相色譜

圖10 混合培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的氣相圖譜

表3 標(biāo)準(zhǔn)物在氣相色譜中對應(yīng)的保留時間

3 結(jié) 論

Pseudomonas putidaKT2442在以苯戊酸和蔗糖為混合碳源為培養(yǎng)基，經(jīng)48～50 h的發(fā)酵培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)可積累含有中長鏈單體的聚羥基脂肪酸酯，且 PHA聚合鏈上含有苯環(huán)。經(jīng)由核磁共振分析可知，苯環(huán)連接在PHA的C5亞甲基上。氣相色譜顯示該單含苯環(huán)單體在 PHA鏈中的含量不是很高，只有1.04%。

由于 PHA鏈上整合有苯環(huán)基團(tuán)，從而可能賦予PHA新的物化性質(zhì)，為PHA的改性和應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。

[1]Steinbüchel A. Polyhydroxyalkanoic acids//Byrom D （ Ed.） .Biomaterials：Novel Materials from Biological Sources [M]. New York：Stockto Press，1991：123-213.

[2]Feng L，Watanabe T. Wang Y，et al. Studies on comonomer compositional distribution of bacterial poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate）s and thermal characteristics of their fractions[J].Biomacromolecules，2002，3（5）：1071-1077.

[3]Hartmann R，Hany R，Geiger T，et al. Tailored biosynthesis of olefinic medium-chain-length poly[（R）-3-hydroxyalkanoates]inPseudomonas putidaGPo1 with improved thermal properties[J].Macromolecules，2004，37：6780-6785.

[4]Hartmann R，Hamy R，Plestcher E，et al. Tailor-made olefinic medium-chain-length poly[（R）-3-hydroxyalkanoates]byPseudomonas putidaGPo1：Batch versus chemostat production[J].Biotechnology and Bioengineering，2006，93：737-746.

[5]Shi F Y，Richard A G. Microbial polyester synthesis：Effects of poly（ethylene glycol）on product composition，repeat unit sequence and group structure[J].Macromolecules，1996，29：10-17.

[6]Devang T S，MinHtien T，Piere A B，et al. Synthesis and properties of hydroxyl-terminated poly（hydroxyalkanoate）s[J].Macromolecules，2000（33）：2875-2880.

[7]Ward P G，O’Connor K E. Bacterial synthesis of polyhydroxyalkanoates containing aromatic and aliphatic monomers byPseudomonas putidaCA-3[J].International Journal of Biological Macromolecules，2005，35：127-133.

[8]Olivera E R，Carnicero D，Jodra R，et al. Genetically engineered Pseudomonas：A factory of new bioplastics with broad applications[J].Environmental Microbiology，2001，3（10）：612-618.

[9]Chung Y L，Lee Y H W，Yen S H，et al. A novel approach for nasopharyngeal carcinoma treatment uses phenylbutyrate as a protein kinase C modulator：Implications for radiosensitization and Ebv-targeted therapy[J].Clinical Cancer Research，2000，6（4）：1452-1458.

[10]Kebebew E，Wong M G，Siperstein A E，et al. Phenylacetate inhibits growth and vascular endothelial growth factor secretion in human thyroid carcinoma cells and modulates their differentiated function[J].J. Clin. Endocrinol. Metab.，1999，84：2840-2847.

[11]Witzig T E，Timm M，Stenson Mary，et al. Introduction of apoptosis in malignant B cells by phenylbutyrate or phenylacetate in combination with chemotherapeutic agents[J].Clinical Cancer Research，2000，6（2）：681-692.

[12]寧永成. 有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定與有機(jī)波譜學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2000：28-30.

[13]Tsutomu Honma，Takeshi Imamura，Takashi Kenmoku，et al.Biosynthesis of novel poly（3-hydroxyalkanoates）containing benzoyl groups[J].Journal of Environmental Biotechnology，2004，4（1）：49-55.

[14]Keenan Thomas M，Nakas James P，Tanenbaum Stuart W.Polyhydroxyalkanoate copolymers from forest biomass[J].Microbiol.Biotechnol.，2006，33：616-626.

[15]Wang Hong-hui，Zhou Xin-rong，Liu Qian，et al. Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate homopolymers byPseudomonas putida[J].Appl. Microbiol. Biotechnol.，2011，89：1497-1507.

Biosynthesis and molecular structure characterization of polyhydroxyalkanoates containing benzoyl group

HUANG Jinbiao1，2，SHANG Long’an1
（1Ningbo Institute of Technology，Zhejiang University，Ningbo 315100，Zhejiang，China；2Department of Chemical and Biochemical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，Zhejiang，China）

Polyhydroxyalkanoates（PHA）with the biodegradability and biocompatibility has become one of the potential medical materials. Its application fields can be enlarged by modifying the PHA’s properties. For this purpose，the PHA was synthesized by the culture ofPseudomonasputidaKT2442 with phenylvaleric acid and sucrose as mixed carbon source. The molecular structure of this biomodified PHA was characterized by NMR，IR and GC. The analysis result indicates that the biomodificated PHA is medium-length PHA which contains 3-hydroxyphenylvalerate monomer，and this monomer accounts for 1.04% of the PHA chain. This will be useful reference for further PHA study.

polyhydroxyalkanoates；biomodify；Pseudomonas putida；mixed carbon source

TQ 323.4

A

1000–6613（2011）10–2282–05

2011-04-04；修改稿日期2011-04-19。

寧波市自然科學(xué)基金項目（2006A61003）。

黃錦標(biāo)（1982—），男，碩士研究生。E-mail huangke1206@163.com。聯(lián)系人：尚龍安，教授，E-mail lashang@nit.net.cn。