顏斌 曹軍 陳勇 楊瑞章 徐邦興 王太全 張丹 高玲

(鹽城出入境檢驗(yàn)檢疫局 江蘇鹽城 224002)

高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星的不確定度

顏斌 曹軍 陳勇 楊瑞章 徐邦興 王太全 張丹 高玲

(鹽城出入境檢驗(yàn)檢疫局 江蘇鹽城 224002)

對高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星含量的不確定度來源進(jìn)行分析與量化。測試樣品中環(huán)丙沙星含量測量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為1.21μg/kg(k=2)。

高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法;水產(chǎn)品;環(huán)丙沙星;測量不確定度

1 前言

目前高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法已廣泛用于水產(chǎn)品中喹諾酮類獸藥(環(huán)丙沙星)的定性定量檢測,為了使其符合CNAS-CL07:2006《測量不確定度評估和報(bào)告通用要求》[1],且在測量數(shù)據(jù)的處理、測量結(jié)果的表達(dá)和測量結(jié)果質(zhì)量評定等方面與國際接軌,本文根據(jù)CNAS-GL06:2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[2],對高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星的測量結(jié)果不確定度進(jìn)行了測量和評定,為科學(xué)評定測量結(jié)果質(zhì)量提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

Thermo Finnigan TSQ Quantum Access液相色譜-高分辨串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有電噴霧電離源。

2.1.2 試劑

環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品:購自Sigma-Aldrich公司,純度≥98%。甲醇:Merck,色譜純;乙腈:南京化學(xué)試劑廠,分析純;無水硫酸鈉:南京化學(xué)試劑廠,分析純;正己烷:南京化學(xué)試劑廠,分析純。

2.2 方法

準(zhǔn)確稱取粉碎均質(zhì)鮰魚肌肉組織樣5.00g(±0.01g)于50mL離心管中,加入約10g無水硫酸鈉,渦旋混勻;加入15 mL乙腈提取液,渦旋混勻2min;3500 rpm離心10min,取上層清液,再用10mL提取液提取2次,渦旋混勻2min;3500 rpm離心10min,合并上層清液,于50℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。準(zhǔn)確加入1.00mL甲醇水混和溶液(5:95),渦旋后再加入0.5 mL正己烷渦旋,轉(zhuǎn)移入1.5mL離心管,15000rmp離心5min,取下層溶液過0.45μm的濾膜到進(jìn)樣瓶中,上儀器測定。

3 不確定度評定過程

3.1 數(shù)學(xué)模型

其中:ω為樣品中環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度(μg/kg);

c為待測樣品溶液中環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度(μg/L);

v為待測溶液的定容體積(mL);

m為稱取樣品的質(zhì)量(g);

frec為回收率校正因子。

3.2 不確定度分量的主要來源

3.2.1 校準(zhǔn)過程引入的不確定度

包括采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得試樣濃度過程中所引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)溶液過程所引入的不確定度。而標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)溶液過程中的不確定度由標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度的不確定度、移液管和容量瓶體積的不確定度、校準(zhǔn)和使用溫度不同導(dǎo)致的不確定度組成。

3.2.2 樣品質(zhì)量引入的不確定度

由天平的最大允許誤差構(gòu)成。

3.2.3 體積引入的不確定度

由定容體積和進(jìn)樣體積的不確定度組成。

3.2.4 制樣過程引入的不確定度

測試樣品的制備過程非常復(fù)雜,需經(jīng)過均質(zhì)、萃取、過濾、凈化、淋洗、濃縮等步驟,每一步操作都會引入不確定度,要確定每一步驟對測量結(jié)果不確定度的貢獻(xiàn)相當(dāng)困難,可采用檢測方法確認(rèn)中的有關(guān)數(shù)據(jù)如回收率等,對制樣過程引入的不確定度進(jìn)行評定。

3.2.5 測試過程隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度

包括樣品的均勻性和代表性、天平的重復(fù)性、體積刻度充滿的重復(fù)性、進(jìn)樣的重復(fù)性和儀器積分面積重復(fù)性等因素引入的不確定度。

4 不確定度分量的評定

4.1 校準(zhǔn)過程引入的不確定度(屬B類不確定度)

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

4.1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品不確定度

環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)儲品純度≥98%,純度誤差為±0.5%,按矩形分布處理,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u(Cs)相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(Cs)=0.29%/98%=0.0030

4.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度

(1)100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制

稱取10.00mg環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)儲品100 mL容量瓶(A級)中,用乙腈定容。使用天平規(guī)定允差為0.05mg,根據(jù)GB12806-1991《實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器單標(biāo)線容量瓶》[3]規(guī)定:A級單標(biāo)線100mL容量瓶的容量允許差為±0.10mL,取矩形分布,則引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配制過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

(2)1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用1 mL移液器將1 mL100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液完全轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶(A級)中,用乙腈定容。根據(jù)GB12806-1991規(guī)定:A級單標(biāo)線100mL容量瓶的容量允許差為±0.10mL,JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》[4]規(guī)定:1mL移液器吸取1mL溶液容量允許差為1%,按矩形分布處理,標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

(3)按上述步驟計(jì)算200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L和5μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.0105、0.0129、0.0183、0.0129、0.0129、0.0129。計(jì)算時取50μg/L濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度值0.0183(最大不確定度值)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:4.1.1.3 溫度效應(yīng)

溫度:容量瓶在20℃校準(zhǔn),本測試在25℃的條件下進(jìn)行。因?yàn)槿芤旱捏w積膨脹系數(shù)遠(yuǎn)大于玻璃的膨脹系數(shù),因此只考慮前者即可。乙腈體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1,產(chǎn)生的體積變化為100mL×5℃×1.37×10-3℃-1=0.685mL,取矩形分布,則溶液溫度對體積的影響所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u(Vtemp)=0.685/3=0.3955(mL);相對不確定度為:urel(Vtemp)=0.3955/100=0.0040。

4.1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對不確定度

4.1.2 采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求得試樣濃度過程中所引入的不確定度

配制環(huán)丙沙星的6個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L和5μg/L),分別用LC-MS/MS測試3次,得到相應(yīng)的峰面積A,采用最小二乘法擬合,得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程Y=aX+b(b為截距,a為斜率)和方程的線性相關(guān)系數(shù),見表1。

表1 環(huán)丙沙星峰面積、線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)

對樣品溶液進(jìn)行3次測定,根據(jù)峰面積用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程求得的平均濃度(C0)為110.40μg/L,則由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

其中:a=71136;b=32053,試驗(yàn)3次P=3,n=6×3=18

Scc為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度殘差的平方和

由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)過程引入的不確定度

4.2 樣品質(zhì)量引入的不確定度(屬B類不確定度)

天平的說明書給出的最大允許誤差0.01g,按矩形分布處理,標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:u(m)0.0058/5.0=0.0012

4.3 體積引入的不確定度(屬B類不確定度)

4.3.1 由定容體積引入的不確定度

樣品經(jīng)過萃取、凈化后用1mL移液器移取1mL甲醇水混和溶液(5:95)溶解,根據(jù)JJG 646-2006中要求,按矩形分布處理,相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度及和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:

4.3.2 由進(jìn)樣體積的引入的不確定度

測試中儀器配置的微量注射器體積為25μL,進(jìn)樣量為25μL,根據(jù)JJG700-1999附錄A《微量注射器的標(biāo)準(zhǔn)》[5],微量注射器體積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1%,按矩形分布處理,則進(jìn)樣體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

4.3.3 由體積引入的相對不確定度

4.4 前處理過程引入的不確定度(屬A類不確定度)

制樣過程產(chǎn)生的不確定度采用100μg/L(與所測定樣品濃度水平相近)5次樣品添加回收率的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。3次回收率測定結(jié)果為:91.5%、93.5%、95.6%、94.2%、92.7%,平均回收率為R=93.5%,標(biāo)準(zhǔn)偏差為S=1.54%,標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:

u(R)=S=0.0154

urel(R)=u(R)/R=0.0165

4.5 測試過程隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的不確定度(屬A類不確定度)

按照SN/T 1751.2-2007《動物源性食品中16種喹諾酮類藥物殘留量檢測方法》[6]要求,測定鮰魚樣品中環(huán)丙沙星殘留量,結(jié)果分別為:22.19μg/kg,22.01μg/kg,22.04μg/kg,平均值ω—=22.08μg/kg,標(biāo)準(zhǔn)偏差s(ω—)=0.0964μg/kg,按矩形分布處理,則測試過程隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:u(ω—)=s(ω—)=0.0964,urel(ω—)=u(ω—)/ω—=0.0044

4.6 合成不確定度

4.7 擴(kuò)展不確定度

擴(kuò)展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子,在95%置信水平下,k=2時,試樣中環(huán)丙沙星含量測定的相對擴(kuò)展不確定度為:

4.8 測量結(jié)果的報(bào)告

測試鮰魚樣品中環(huán)丙沙星測量結(jié)果:

[1] CNAS CL07:2006測量不確定度評估和報(bào)告通用要求[S].

[2] CNAS GL06:2006化學(xué)分析中不確定度的評估指南[S].

[3] GB12806-1991實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器單標(biāo)線容量瓶[S].

[4] JJG 646-2006移液器檢定規(guī)程[S].

[5] JJG700-1999氣相色譜儀檢定規(guī)程[S].

[6] SN/T 1751.2-2007動物源性食品中16種喹諾酮類藥物殘留量檢測方法[S].

Uncertainty of Measurement of Ciprofloxac in Residues in Aquatic Products by HPLC-MS/MS

Yan Bin,Cao Jun,Chen Yong,Yang Ruizhang,Xu Bangxing,Wang Taiquan,Zhang Dan,Gao Ling
(Yancheng Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yancheng,Jiangsu,224002)

The uncertainty of measurement in determination of ciprofloxacin in aquatic products by HPLC-MS/MS was evaluated.The main sources of uncertainty resulted from the determination process were discussed and calculated.The expanded uncertainty of ciprofloxacin determination of was 1.21μg/kg(k=2).

HPLC-MS/MS;Aquatic Products;Ciprofloxacin;Uncertainty of measurement

O657.63

國家質(zhì)檢總局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2010IK186)