姜蘭芳，周光明*，李艷艷

(發(fā)光與實時分析教育部重點實驗室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

膠束萃取-高效液相色譜法同時測定葛根粉中5種異黃酮

姜蘭芳，周光明*，李艷艷

(發(fā)光與實時分析教育部重點實驗室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400715)

目的：基于表面活性劑作為萃取劑，應(yīng)用膠束萃取-反相高效液相色譜法測定葛根粉中葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素5種異黃酮的含量。方法：以非離子表面活性劑Triton X-114為萃取劑，采用Phenomenex C18色譜柱，甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.25%冰醋酸溶液為流動相，梯度洗脫，利用紫外檢測器在250nm波長處進(jìn)行檢測?？疾焐V測定條件，優(yōu)化膠束萃取和濁點預(yù)富集參數(shù)。結(jié)果：采用3g/100mL Triton X-114表面活性劑，液固比為100:1(mL/g)，40℃超聲萃取30min，所得的萃取率最大。在表面活性劑提取液中，加入一定量的氯化鈉進(jìn)行濁點預(yù)富集，可以提高萃取率和預(yù)富集因子。該方法的定性檢測限范圍是0.016～0.079μg/mL(RSN=3)，平均回收率為93.7%～98.86%，預(yù)富集因子平均值可達(dá)到12.5。結(jié)論：該方法簡便快速、靈敏可靠、綠色環(huán)保，適用于葛根粉中葛根素等5種異黃酮成分含量的測定和產(chǎn)品質(zhì)量控制。

膠束萃?。粷狳c萃?。籘riton X-114表面活性劑；異黃酮；高效液相色譜

葛根為豆科植物野葛的干燥根[1]，是常用中藥材，現(xiàn)代研究證實，葛根中的主要有效成分為葛根素等異黃酮類化合物，該類化合物具有抗氧化性，改善心、腦血液循環(huán)、擴張冠狀動脈、降血壓、降血糖之功效[2-3]。葛根又屬于藥食同源，也廣泛地被應(yīng)用于保健食品和食品中。有關(guān)葛根中葛根素等異黃酮的含量測定研究已有不少報道[4-8]，但對市售的葛根粉中葛根素含量測定報道不多，本實驗針對葛根粉中葛根素等異黃酮的提取、預(yù)富集條件以及測試條件等進(jìn)行優(yōu)化，并采用高效液相色譜法對葛根粉樣品進(jìn)行定量分析。

測定中草藥葛根樣品中的異黃酮含量通常采用高效液相色譜法[4-8]、高效薄層色譜法[9]和紅外光譜法[10]等，其樣品前處理常采用液-液萃取法、索氏萃取法和固相萃取法，這些方法都使用大量的有機溶劑，費時耗力而且在蒸發(fā)濃縮過程中有部分被測物丟失。膠束萃取(micelle-mediated extraction，MME)和濁點萃取(cloud point extraction，CPE)預(yù)富集方法是近年來發(fā)展起來的一種特殊液液萃取分離技術(shù)，它是利用表面活性劑膠束水溶液的增溶性和濁點現(xiàn)象，改變實驗參數(shù)引發(fā)相分離，可以使表面活性劑結(jié)合的疏水性物質(zhì)與親水性物質(zhì)達(dá)到理想的分離效果，從而可以提高回收率和預(yù)富集因子。與上述傳統(tǒng)前處理方法比較，該方法只需要一定濃度的表面活性劑，具有試劑用量小、環(huán)境友好、萃取效率高、操作簡便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品[11-15]、醫(yī)藥樣品[16-17]和固體樣品[18-22]的前處理中。

本實驗擬以非離子表面活性劑Triton X-114為萃取劑，利用膠束萃取技術(shù)來提取、分離葛根粉中的葛根素等異黃酮類物質(zhì)，應(yīng)用反相高效液相色譜法(R PHPLC)分析測定其含量，以期為評價葛根粉這一藥食資源的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根粉 重慶市場。

葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素對照品 天津中新藥業(yè)中藥現(xiàn)代化技術(shù)工程中心；甲醇(分析純) 成都市科龍化工試劑廠；冰乙酸(分析純)重慶東方試劑廠；氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉(均為分析純) 重慶北碚化學(xué)試劑廠；二次蒸餾水為實驗室自制；Triton X-114 深圳美荷生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT液相色譜輸液泵、SPD-20A紫外檢測器、CTO-10AS柱溫箱、LC-Slution色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 日本Shimadzu公司；色譜柱為Phenomenex C18(150mm×4.6mm，5μm) 廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司；0.45μm針頭微孔濾膜過濾器 重慶鈦新儀器有限公司；KH-3200B型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；TGL-16G高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；SZ-2自動雙重純化水蒸餾器 上海滬西分析儀器；LIDA pH計 上海理達(dá)儀器廠；FA2004A型分析天平 上海精天電子儀器公司。

1.3 溶液的配制

對照品儲備液：分別精密稱取對照品葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素適量，加甲醇配制成葛根素273μg/mL、大豆苷100μg/mL、大豆苷元500μg/mL、染料木苷100μg/mL、染料木素160μg/mL的溶液，作為儲備溶液，待用。

對照品混合溶液：精密吸取5種異黃酮儲備液適量，用3g/100mL Triton X-114表面活性劑溶液配制成一系列濃度不同的對照品混合溶液，冰箱(4℃)內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品處理

膠束萃?。簻?zhǔn)確稱量0.1g葛根粉樣品，置15mL離心管中，加入10mL 3g/100mL Triton X-114水溶液搖勻后放入40℃超聲水浴中超聲萃取30min，萃取完成后3000r/min離心10min，將萃取上清液經(jīng)0.45μm有機濾膜過濾后待用。

CPE富集：將上述萃取上清液轉(zhuǎn)入10mL的離心管中，加入1.76g NaCl旋渦振蕩1min后，置入55℃恒溫水浴中平衡40min，3000r/min離心5min使兩相分離，棄去上層水相，分取下層表面活性劑富集相，用甲醇定容到1.0mL來降低表面活性劑的黏度，經(jīng)0.45μm有機濾膜過濾后供高效液相色譜分析。

1.5 色譜條件

Phenomenex C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相由體積分?jǐn)?shù)0.25%冰乙酸和甲醇組成(A為體積分?jǐn)?shù)0.25%冰乙酸，B為甲醇)，采用梯度洗脫，洗脫程序為：0～15min，15%～80% B；15～20min，80% B；20～22min，80%～15% B；體積流量：0.8mL/min；進(jìn)樣量：2 5μL；檢測波長：25 0n m；柱溫：20℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑的比較

為考察Triton X-114表面活性劑的提取效果，在相同的條件下，分別研究甲醇、5 0%甲醇、乙醇、環(huán)己烷、丙酮和正己烷6種常用萃取劑與3g/100mL Triton X-114非離子表面活性劑對0.1g葛根粉中5種異黃酮提取含量的影響。結(jié)果表明采用3g/100mL Triton X-114為提取溶劑，獲得的葛根異黃酮類物質(zhì)的提取量均為最大。

2.2 膠束萃取參數(shù)的選擇和優(yōu)化

2.2.1 表面活性劑質(zhì)量濃度的選擇

分別考察質(zhì)量濃度為1.5、3、4、6、12g/100mL的Triton X-114表面活性劑對葛根粉中異黃酮類物質(zhì)的提取效果。結(jié)果表明3g/100mL Triton X-114表面劑提取效果最好，結(jié)果見圖1。

圖1 Triton X-114表面活性劑質(zhì)量濃度對異黃酮提取效率的影響Fig.1 Chromatograms of standard isoflavonoids, surfactant and samples

2.2.2 液固比的選擇

考察液固比為33.3:1、40:1、66.7:1、100:1、200:1(mL/g)的樣品和表面活性劑混合液。結(jié)果表明液固比為100:1(mL/g)的葛根粉表面活性劑溶液提取效果較好。實驗結(jié)果見圖2。

圖2 液固比對異黃酮提取效率的影響Fig.2 Effect of Triton X-114 surfactant concentration on extraction rate of isoflavonoids

2.2.3 萃取溫度和時間的選擇

公立高等院校作為財政撥款的事業(yè)單位，其預(yù)算是政府財政預(yù)算的重要組成部分，政府公共財政改革必將對高校事業(yè)發(fā)展產(chǎn)生比較大的影響，也給高?，F(xiàn)行的預(yù)算編制帶來不小的沖擊。高校應(yīng)該順勢而為，主動適應(yīng)國家財政預(yù)算管理的改革節(jié)奏，建立跨年度預(yù)算平衡機制，因地制宜，適時運用滾動預(yù)算編制方法，編制與高校事業(yè)發(fā)展相適應(yīng)的中長期預(yù)算。

為了在盡可能低的萃取溫度和最短的時間內(nèi)達(dá)到盡可能大的萃取率，按照實驗方法研究不同溫度和時間對提取含量的影響。超聲提取溫度4 0℃時，超聲時間30min以上提取含量均為最大，實驗中選擇在40℃時超聲提取30min。

2.3 CPE富集參數(shù)的選擇和優(yōu)化

葛根異黃酮通過膠束萃取后利用表面活性劑的濁點現(xiàn)象進(jìn)行預(yù)富集來提高預(yù)富集因子和回收率。通常促使CPE預(yù)富集的方法有兩種：一種是升高溫度，使樣品溶液的溫度高于表面活性劑的濁點溫度；另一種是通過加入電解質(zhì)來促使兩相的分離，電解質(zhì)的加入增加了萃取環(huán)境的離子強度，可使水相密度增大，降低極性物質(zhì)在水中的溶解性，更易于進(jìn)入富集相，另一方面也會使表面活性劑的疏水性增強，促使兩相分離[23]。為改善分析物在膠束萃取后的預(yù)富集效果，考察電解質(zhì)種類和濃度、平衡溫度和時間對CPE5種異黃酮回收率的影響。

2.3.1 電解質(zhì)種類和濃度的影響

考察NaCl、Na2CO3和Na2SO43種電解質(zhì)對上述表面活性劑萃取液的預(yù)富集效果。結(jié)果表明加入NaCl可以使表面活性劑富集相的體積更小，回收率最大。因此實驗選擇NaCl電解質(zhì)作為修飾劑來增強離子強度。加入不同濃度的NaCl，考察離子強度對萃取率的影響。當(dāng)NaCl濃度為0.3mol/L時，萃取率達(dá)到最大。

2.3.2 平衡溫度的影響

當(dāng)表面活性劑濃度一定時，溫度達(dá)到濁點溫度后，隨著溫度的升高萃取率逐漸增大，表面活性劑富集相體積減小。在保證萃取完全的前提下，應(yīng)該采用盡可能低的平衡溫度。不同平衡溫度對5種異黃酮萃取率的影響見圖3(NaCl濃度為0.3mol/L和平衡時間為20min)，結(jié)果表明，在55℃平衡溫度下，萃取率達(dá)到最大值，因此實驗選擇在55℃作為CPE預(yù)富集的平衡溫度。

圖3 平衡溫度對異黃酮類物質(zhì)回收率的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of isoflavonoids

圖4 平衡時間對異黃酮類物質(zhì)回收率的影響Fig.4 Effect of equilibrium temperature on recovery rate of isoflavonoids

在0.3mol/L NaCl和平衡溫度為55℃的條件下，研究平衡時間對葛根粉中葛根素、大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素回收率的影響見圖4。結(jié)果表明，平衡時間為40min獲得的5種異黃酮類物質(zhì)的回收率均為最大。

2.4 分析方法的確認(rèn)

2.4.1 方法專屬性考察

對照品混合液按2.3節(jié)的方法操作，進(jìn)樣20μL，記錄色譜見圖5A；取空白3% Triton X-114表面活性劑10mL，按2.3節(jié)方法操作，進(jìn)樣20μL，記錄色譜圖5B；從圖5B可以看出，表面活性劑水溶液的紫外吸收很弱，不干擾5種異黃酮的分析測定。從圖5C和圖5D比較可以得知表面活性劑通過CPE預(yù)富集可以使被測物達(dá)到較好的預(yù)富集效果。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品、表面活性劑和樣品色譜圖Fig.5 Effect of equilibrium time on recovery rate of isoflavonoids

2.4.2 線性關(guān)系

將一系列質(zhì)量濃度不同的對照品混合溶液按1.5節(jié)色譜條件注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表1。在0.078～136μg/mL范圍內(nèi)質(zhì)量濃度和峰面積呈較好的相關(guān)性，r＞0.9996，在信噪比RSN=3時，檢出限在0.016～0.079μg/mL，在信噪比RSN=10時，定量限在0.054～0.260μg/mL。

表1 線性關(guān)系實驗結(jié)果(n=5)Table 1 Linear relationship between peak area and the concentration of isoflavonoids (n=5)

2.4.3 精密度和重現(xiàn)性

精密吸取對照品混合溶液20μL，按選定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素對照品峰面積的RSD分別為0.94%、3.29%、2.69%、1.61%、2.02%、1.38%，表明儀器的精密度良好。精密稱取同一批葛根粉樣品5份，按1.4節(jié)方法制備樣品溶液并進(jìn)行HPLC測定，葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素峰面積的RSD(n=5)分別為3.34%、2.48%、0.74%、1.83%和1.76%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 提取回收率和穩(wěn)定性

精密稱取已知含量的同一葛根粉樣品0.1g，稱定9份分成3組，每組準(zhǔn)確加入不同量對照品混合液，按1.4節(jié)方法制備樣品溶液，HPLC測定。葛根素、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的平均加標(biāo)回收率為93.70%～98.86%，預(yù)富集因子平均值可達(dá)到12.5。測定結(jié)果見表2。

表2 5種異黃酮的加標(biāo)回收率和RSD(n=3)Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of 5 isoflavonoids in spiked samples

2.4.5 樣品含量的測定

取3批葛根粉樣品，依次按1.4節(jié)方法處理樣品，按選定的色譜條件進(jìn)樣，測定含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(n=3)Table 3 Contents of isoflavonoids in real samples determined by this method (n=3)mg/mL

3 結(jié) 論

本方法以非離子表面活性劑Triton X-114為溶劑對葛根粉中的葛根素等異黃酮類物質(zhì)進(jìn)行超聲波提取，提取液利用表面活性劑的濁點現(xiàn)象來預(yù)富集濃縮，用高效液相色譜法進(jìn)行測定，采用UV作為檢測器，表面活性劑對被測物的紫外吸收無影響，能準(zhǔn)確地對葛根粉中的葛根素等異黃酮類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，且檢測線性范圍較寬，精密度較好，具有操作簡便、快速、安全、經(jīng)濟、選擇性好及檢出限低等優(yōu)點。

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Simultaneous Determination of Isoflavonoids in Kudzu Powder by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Micelle-mediated Extraction

JIANG Lan-fang，ZHOU Guang-ming*，LI Yan-yan
(Key Laboratory on Luminescence and Real-time Analysis, Ministry of Education, School of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University, Chongqing 400715, China)

Objective: A reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) coupled with micelle-mediated extraction method was developed for the simultaneous determination of five isoflavonoids such as puerarin, daidzin, daidzein,genistin and genistein from kudzu powder. Methods: The non-ionic surfactant Triton X-114 was used as the extraction solvent.The chromatographic separation of samples was performed on a Phenomenex C18 column using methanol-0.25% glacial acetic acid as the mobile phase by means of gradient elution and a UV detector set at 250 nm was used for detection. The chromatographic conditions were explored to optimize the micelle-mediated extraction and enrichment of cloud points. Results: The highest extraction rate of isoflavonoids was achieved using 3 g/100 mL Triton X-114 as the surfactant for ultrasonic-assisted extraction at 40 ℃ for 30 min with a material/liquid ratio of 1: 100 (g/mL). Sodium chloride was added to the extract to improve extraction rate and cloud point enrichment. The limit of detection (LOD) of this developed method was in the range of 0.016－0.079μg/mL(RSN=3) with average recovery rates ranging between 93.7% and 98.86%. The enrichment factor was approximately 12.5.Conclusion: This developed method is characteristics of simple operation, low cost, high extraction efficiency and less pollution to environment, which is suitable for the quality control of five isoflavonoids in kudzu powder.

micelle-mediated extraction；cloud point extraction (CPE)；Triton X-114 surfactant；isoflavonoids；high performance liquid chromatography (HPLC)

R284.1

A

1002-6630(2011)06-0186-05

2010-05-25

科技部重大專項(2008ZX07315)；重慶市自然科學(xué)基金項目(CSTC2007BB5370)

姜蘭芳(1983—)，女，碩士研究生，研究方向為色譜分析。E-mail：jianglf@swu.edu.cn

*通信作者：周光明(1964—)，男，教授，博士后，研究方向為色譜及其聯(lián)用技術(shù)。E-mail：gmzhou@swu.edu.cn